基于Box-Behnken實驗優(yōu)化龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的制備

郝吉福， 王建筑， 郭豐廣， 孔志峰， 李 菲， 彭新生

(1．山東泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016;2．廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東東莞523808)

近年來，微粒給藥系統(tǒng)，如微乳、傳遞體、醇質(zhì)體、脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒以及藥物納米混懸液等在透皮給藥研究中取得較大進展［1］;其中固體脂質(zhì)納米粒［2］(solid lipid nano-particle，SLN)是指粒徑在10～1 000 nm的范圍，以固態(tài)類脂化合物(天然或合成)為載體，將藥物包裹于類脂核中制成的固態(tài)膠粒，SLN具有皮膚附著性強、納米尺度效應(yīng)使其易于通過融合和穿透機制使其在經(jīng)皮滲透方面具有獨特優(yōu)勢［3］。

國產(chǎn)血竭稱為龍血竭，為百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹 Dracaena cochinchinensis(Lour．)S．C．Chen的含脂木材經(jīng)提取得到的樹脂，具有活血散瘀、定痛止血、生肌斂瘡等功效，是治療跌打損傷外用制劑中的常用藥物，作為新藥材收載于1999年國家藥品監(jiān)督管理局頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)中［4］。

本研究采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方，考察藥物含量、油相、乳化劑Poloxamer 188等因素對龍血竭-SLN包封率、載藥量和粒徑的綜合影響，旨在將龍血竭制備成固體脂質(zhì)納米粒，以期能增強龍血竭透過皮膚吸收的性能，為其在外用治療方面提供新的劑型。

1 材料與試劑

單硬脂酸甘油酯(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純);PluronicF-68(poloxamer188，由 BASF提供);龍血竭原料藥(中外合作湖南東田制藥有限公司，批號:20090126，含龍血素A 37．4%);龍血素A對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110811-200704);水為重蒸餾水，其它所用試劑均為分析純。

JY92-Ⅱ探頭超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);超速冷凍離心機(日本Hitachi公司);JM21200EX透射電鏡(日本電子公司);Mastersizer 3000粒度分析儀(英國馬爾文公司);Zetasizer Nano電位分析儀(英國馬爾文公司);WZS-185濁度計(上海雷磁);EYELA FDU-1200冷凍干燥機(日本理化器械株氏會社)。

2 方法與結(jié)果

2．1 龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的制備 稱取處方量的龍血竭原料藥、單硬脂酸甘油酯，溶于適量無水乙醇中，置于80℃恒溫水浴使之充分溶解，形成油相。同時將適量poloxamer188溶于25 mL雙蒸水中，恒溫水浴至80℃左右形成水相。將熔融好的油相在攪拌條件下緩緩加入水相，制得磚紅色初乳，在(80±5)℃保溫條件下用探頭式超聲細(xì)胞粉碎儀超聲10 min(功率700 w)，得紅色透明的膠體溶液，將其快速分散于50 mL 0～2℃雙蒸水中，冰浴條件下攪拌至充分冷卻，即得龍血竭固體脂質(zhì)納米粒水分散體。

2．2 龍血竭固體脂質(zhì)納米粒包封率和載藥量的測定

2．2．1 龍血竭測定方法的建立 龍血竭中的主要成分多為二氫查耳酮類化合物［5］，該類物質(zhì)在280 nm左右有最大吸收波長，故以龍血素A作為指標(biāo)成分測定龍血竭中二氫查耳酮類化合物的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而進行包封率和載藥量的評價。

2．2．1．1 對照品溶液制備 精密稱取龍血素A對照品15．1 mg置于25 mL量瓶中，加乙醇溶解后用蒸餾水定容至刻度，得質(zhì)量濃度為604 mg/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4℃冰箱備用。

2．2．1．2 龍血竭SLN及空白SLN供試品溶液的制備 精密量取龍血竭SLN水分散體溶液1 mL，置于25 mL量瓶中加乙醇適量，水浴80℃加熱10 min后，冷卻至常溫，25 000 r/min離心15 min，取上清液加乙醇稀釋至刻度，再精密吸取上清液2 mL至10 mL量瓶中，蒸餾水定容，經(jīng)0．22μm微孔濾膜過濾，即得龍血竭SLN供試品溶液;同法制得空白SLN供試品溶液。

2．2．1．3 最大吸收波長的測定 取對照品溶液與樣品溶液適量，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果表明其在282 nm處有最大吸收?？瞻譙LN供試品溶液在282 nm處無干擾，故選擇282 nm作為最大吸收波長。

2．2．1．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對照品溶液0．1、0．2、0．4、0．6、0．8 mL 于10 mL 量瓶中，用80%乙醇稀釋至刻度，在波長282 nm處測定吸光度A，以A對相應(yīng)濃度C進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0．001+0．019C，r=0．999 7，表明龍血素 A在6．04～48．32μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．2．2 包封率和載藥量的測定 采用低溫超速離心法測定龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的包封率。精密量取固體脂質(zhì)納米粒2．0 mL置超速離心管中，25 000 r/min離心15min，移取下層澄清液，在波長282 nm處測定吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定游離龍血竭(M游離)，同時量取固體脂質(zhì)納米粒溶液0．5 mL，加入適量無水乙醇，水浴加熱，冷卻后25 000 r/min離心，將上清液置10mL量瓶中蒸餾水稀釋至刻度，測定上清液中血竭的總量(M總量)，根據(jù)公式1計算藥物包封率。

采用冷凍干燥法測定龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的載藥量。精密量取固體脂質(zhì)納米粒溶液2．0 mL經(jīng)冷凍干燥后測定凍干粉末質(zhì)量(M凍干)，根據(jù)公式2計算藥物載藥量。

2．3 濁度的測定 所制備的固體脂質(zhì)納米粒為磚紅色透明膠體溶液，通過測定樣品溶液的濁度(NTU)可以間接反映出其粒徑大小。精密量取所制備的固體脂質(zhì)納米粒溶液5．0 mL置于25 mL量瓶中，加雙蒸水稀釋至刻度后，采用WZS-185濁度計測定濁度。

2．4 優(yōu)化實驗

2．4．1 實驗設(shè)計 在此實驗中，選擇對龍血竭固體脂質(zhì)納米粒的制備影響顯著的3個因素，即單硬脂酸甘油酯的用量(X1)，泊洛沙姆188的用量(X2)以及藥物占油相的比例(X3)，每個因素的低、中、高三水平分別記作－1、0、+1，設(shè)計因素水平見表1;以固體脂質(zhì)納米粒的包封率(Y1)、濁度(Y2)和載藥量(Y3)為響應(yīng)值，結(jié)果見表2;建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化處方，進行Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化實驗，并采用design expert7．1．3軟件對實驗數(shù)據(jù)進行擬合分析。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計的因素和水平表Tab．1 Variables and levels in the Box-Behnken design

2．4．2 數(shù)據(jù)處理 按表2處方制備固體脂質(zhì)納米粒，測定包封率Y1(EE%)、Y2濁度(NTU)、Y3載藥量(DL%)3個指標(biāo)，結(jié)果見表2，利用Box-Behnken實驗軟件對各指標(biāo)實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得二次多元回歸模型為:

Y1=0．99 － 1．259X1+6．243X2+4．445X3－9．623X1X2+4．289X1X3－ 6．286X2X3+2．442X21－6．168X22－3．541X23，經(jīng) F 值檢驗顯示方程不顯著(P＞0．05，r=0．896 4)，表明該回歸模型的擬合情況不是很理想，不能很準(zhǔn)確預(yù)測實際包封率。

Y2=38．00+1．92X1－ 40．08X2－ 19．75X3+11．50X1X2－ 18．67X1X3+34．33X2X3－ 16．17X21+45．67X22，經(jīng) F值檢驗顯示總模型方程顯著(P＜0．05，r=0．978 9)，回歸方程的代表性較好，能預(yù)測實際情況。

Y3=9．03 －1．00X1+0．02X2+3．11X3－0．022 X1X2+2．04X1X3－0．025X2X3+1．04X21－1．04X22+0．81X23，經(jīng) F值檢驗顯示總模型方程顯著(P＜0．05，r=0．931)，表明該回歸模型的擬合情況較理想，可以預(yù)測實際載藥量。

2．4．2 效應(yīng)面分析預(yù)測與處方優(yōu)化 根據(jù)劑型設(shè)計需要，希望獲得較高的包封率(EE%)和載藥量(DL)最高而濁度(NTU)較小的處方，應(yīng)用Design expert實驗設(shè)計軟件繪制各因變量對響應(yīng)值影響的三維曲面圖(見圖1)。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)值結(jié)果(n=3)Tab．2 Encapsulation efficiency，NTU and drug loading of formulations in Box-Behnken design(n=3)

從圖1可以看出各設(shè)計因素對響應(yīng)值的影響。在對包封率的影響中，當(dāng)油相含量固定時，包封率隨藥物與表面活性劑含量的增加而增大，這可能由于隨表面活性劑含量的增加，提高了藥物在水相中的溶解能力，因此一些藥物被結(jié)合在固體脂質(zhì)納米粒的表面，而使包封率提高;隨藥物含量的增加藥物在脂質(zhì)中的溶解度相應(yīng)增加，提高包封率。表面活性劑的含量對濁度具有顯著性影響，增加表面活性劑的比例，使?jié)岫冉档?，因為SLN屬于高分散體系，表面活性劑含量的增加能夠降低兩相之間的表面張力，提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性。在不同因素對載藥量的影響中，表面活性劑和藥物的含量發(fā)揮重要的作用，這可能與隨表面活性劑含量增加，因包封藥物增加而使載藥量增加;但當(dāng)表面活性劑量固定時，隨脂質(zhì)增加載藥量呈減小趨勢。

采用實驗設(shè)計軟件對目標(biāo)限定條件進行優(yōu)化，將代碼數(shù)值轉(zhuǎn)化成優(yōu)化的實際數(shù)值，優(yōu)化后處方為:5%單硬脂酸甘油酯、5．39%的poloxmer 188作為乳化劑，藥物與脂質(zhì)的比例為15%。

2．4．3 固體脂質(zhì)納米粒的表征 按優(yōu)化處方采用2．1項下實驗方法制備3批龍血竭固體脂質(zhì)納米粒，其包封率、載藥量和濁度值見表3。

將所制備的固體脂質(zhì)納米粒進行電鏡觀察，測定其粒徑分布范圍及ζ-電位，平均粒徑為326．7 nm，PdI為0．230，ζ-電位為 －10．8 mv。結(jié)果見圖2 ～3。

圖1 各因素與響應(yīng)值的三維圖Fig．1 Three-dimensional response surface plot show ing effect of independent factors on response values

表3 龍血竭固體脂質(zhì)納米粒模型驗證實驗結(jié)果Tab．3 Actual validation value of Resina Draconisloading SLN

圖2 龍血竭固體脂質(zhì)納米粒掃描電鏡形態(tài)圖Fig．2 Scanning electron m icroscopy photography of Resina Draconis-loading SLN

圖3 龍血竭固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布及ζ-電位圖Fig．3 Particle size distribution and zeta-potential of Resina Draconis-loading SLN

2．5 龍血竭固體脂質(zhì)納米粒體外釋藥模型考察采用透析法進行龍血竭固體脂質(zhì)納米粒體外釋放研究［6-7］。將2 mL龍血竭固體脂質(zhì)納米粒混懸液加入透析袋中(34-14×500CLR)，兩端用線扎緊，浸入盛有200 mL釋放介質(zhì)(40%乙醇溶液，用PH7．8～8．0磷酸鹽緩沖液配制)的錐形瓶中，于振蕩器中維持(37±0．5)℃恒溫，振蕩頻率為100 r/min進行動態(tài)透析。于預(yù)定時間點 0．5、1、2、4、6、8、24、48、72、96、120 h取釋放介質(zhì)5．0 mL，同時補加等溫等量的介質(zhì);經(jīng)0．45μm的微孔濾膜過濾后，用紫外可見分光光度法測定，計算累積釋放百分率。取等量龍血竭藥材溶于2 mL無水乙醇制成對照液，同法操作，計算累積釋放百分率;釋藥曲線見圖4。

圖4 龍血竭與固體脂質(zhì)納米粒體外釋藥曲線圖Fig．4 In vitro drug release curve of Resina Draconis and SLN

龍血竭藥材的釋藥相對較快，而且在整個取樣時間內(nèi)，前8 h釋藥速度較快接近75%;而龍血竭SLN釋放相對緩慢而且均勻，但釋藥初期有一定的突釋效應(yīng)，可能是受未包封藥物初期迅速溶出釋放的影響，將龍血竭制成固體脂質(zhì)納米粒達到了緩釋釋藥的目的。根據(jù)體外藥物釋放數(shù)據(jù)對龍血竭固體脂質(zhì)納米粒進行數(shù)據(jù)處理及釋藥模型的擬合，結(jié)果見表4。

表4 固體脂質(zhì)納米粒體外釋藥動力學(xué)Tab．4 Kinetics of in vitro drug release from Resina Draconis-SLN

從各釋藥方程模型擬合結(jié)果來看，以Ritger-Peppas方程釋藥曲線擬合的相關(guān)系數(shù)最大，其中釋放指數(shù)n值為0．386 9，表明其釋藥過程符合 Fick擴散，即以藥物擴散機制為主。

3 討論

3．1 在制備固體脂質(zhì)納米粒的過程中是先將用溶劑加熱溶解的油相分散到水相中形成微乳，通過超聲使其進一步分散得到納米乳，然后快速冷卻至油相熔點以下形成使油相凝固而形成固態(tài)脂質(zhì)納米粒，因此固體脂質(zhì)納米粒的粒徑與油相液滴的分散狀態(tài)有關(guān)，取決于溶劑在溶劑-脂質(zhì)與水相界面的快速擴散，有機溶劑通過界面的擴散速度是影響粒徑的關(guān)鍵因素［8］，除此之外還涉及到超聲功率的選擇，超聲時間，在以后制備工藝研究中進一步探討。

3．2 在采用Box-Behnken實驗設(shè)計優(yōu)化龍血竭固體脂質(zhì)納米粒處方的過程中，從各因素與響應(yīng)值之間的三維效應(yīng)曲面圖(圖1)可以看出，隨油相含量的增加，包封率和載藥量變化趨勢不明顯，這可能與單硬脂酸甘油酯與龍血竭之間的親和力不高有關(guān)系;意味著在以后實驗中尚需進一步選擇適合的油相來提高包封率及載藥量;濁度呈增加趨勢，意味著所制備的SLN的粒徑變大，原因是隨脂質(zhì)濃度的增大，在高濃度情況下脂質(zhì)會發(fā)生合并，同時脂質(zhì)提供額外的空間用來包封藥物分子，減少總的表面積而使粒徑變大;隨poloxamer188濃度的增加濁度減小，表明SLN的粒徑減小，這由于表面活性劑能夠降低水相和油相的表面張力，同時有助于穩(wěn)定新生成的相而防止粒子聚集。因此在考慮SLN處方時要進行綜合評價從而得出最優(yōu)處方。

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