三七皂苷長(zhǎng)循環(huán)納米粒的性質(zhì)研究

趙國(guó)巍， 陳緒龍，2， 廖正根*， 梁新麗， 祝婧云， 招麗君， 王春柳

(1．江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004;2．九江學(xué)院，臨床醫(yī)學(xué)院，江西九江332000)

三七皂苷(Panaxnotoginseng saponins，PNS)具有保護(hù)心肌、降低血壓、增加心腦血流量等藥理作用［1］。目前市售為常規(guī)口服劑型和注射劑，注射劑療效確切，但存在過敏反應(yīng)等問題;因PNS為易溶解難滲透的Ⅲ類藥物［2］，在胃腸道中不穩(wěn)定，其口服制劑生物利用度低。納米技術(shù)能提高藥物穩(wěn)定性和滲透性，但納米粒主要集中在單核巨噬細(xì)胞豐富的器官，對(duì)于靶部位不在這些器官的藥物，藥物在此濃集使得藥物在血液中循環(huán)時(shí)間短。長(zhǎng)循環(huán)納米粒能夠解決這些問題，長(zhǎng)循環(huán)納米粒(long-nanoparticles，NPs)一般是指在普通納米粒的表面用親水性的高分子材料如PEG、PEO、MPEG-PLGA等以物理吸附或化學(xué)鍵合的方法進(jìn)行修飾。長(zhǎng)循環(huán)納米粒通常對(duì)所攜帶的藥物具有緩釋、靶向、保護(hù)、提高療效和降低毒副作用等特點(diǎn)［3］。本實(shí)驗(yàn)采用多種分析測(cè)試手段對(duì)制備的PNS-LCN進(jìn)行性質(zhì)研究，為納米粒的質(zhì)量控制和制劑學(xué)研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司)，乳化機(jī)(FA25 model上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司)，Malvern納米粒度儀(英國(guó)馬爾文公司)，VERTEX 70型紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)，DSC分析儀(美國(guó) PE公司)，D8ADVANCE型X射線衍射儀(德國(guó)Beuker-axc公司)，TEM-l00CX透射電鏡(日本電子公司)，透析袋(Pore size 3000，美國(guó) Fisher Scientific公司)。

1．2 試藥 三七皂苷R1(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110745-200415)，人參皂苷Rg1(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110703-200726)，人參皂苷Rb1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110704-200318)，三七總皂苷樣品(西昌市杰象藥物原料有限公司)，聚乙二醇單甲醚-聚乳酸共聚物(MPEG-PLGA，MPEG ∶PLGA=50 ∶50，分子量20 000，山東省醫(yī)療器械研究所)，殼聚糖(Chitosan，脫乙酰度60%，黏度26 mPa·s，浙江金殼生物化學(xué)有限公司)，甘露醇(中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)，膽固醇、卵磷脂(上?？笊锛夹g(shù)有限公司)，乙腈、甲醇為色譜純;水為超純水;其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 三七皂苷長(zhǎng)循環(huán)納米粒的制備及形態(tài)觀察采用復(fù)乳化法制備［4］，取三七總皂苷適量溶解于pH值為9的水溶液中，作為內(nèi)水相W1;取MPEG-PLA適量溶解于二氯甲烷中，作為油相O，膽固醇和卵磷脂(1∶1)溶入油相中作為乳化劑;殼聚糖水溶液為外水相W2?；旌?W1相與 O相(W1∶O=1∶5，v/v)，振搖分散，然后采用乳化劑高速攪拌120 s制得W1/O乳劑，將上述W1/O乳劑快速加入一定體積的外水相 W2中，(W1/O ∶W2=1 ∶2，v/v)，用乳化機(jī)高速攪拌120 s即得W1/O/W2復(fù)乳，得到的復(fù)乳通過注射器快速注入到45℃條件下中速磁力攪拌的100 mL殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌至二氯甲烷揮發(fā)完全，即得乳光明顯的淡藍(lán)色的納米粒膠體溶液。加入適量的甘露醇作保護(hù)劑，置于－40℃冷凍干燥機(jī)中，按優(yōu)化后的升溫程序干燥，取出后立即壓蓋密封，即得PNS-LCN凍干粉。取已制備好的納米粒凍干粉適量，無水乙醇稀釋后采用透射電鏡(TEM)觀察納米粒的基本形態(tài)，結(jié)果見圖1。

圖1 PNS長(zhǎng)循環(huán)納米粒TEMFig．1 The transm ission electron m icroscope investigation of PNS-LCN

PNS-LCN溶液采用反透析法［5］測(cè)得其包封率和載藥量分別為52．25%、13．23%。PNS-LCN凍干粉外觀均勻，呈疏松狀物，表面光潔細(xì)膩，具有足夠的強(qiáng)度，振搖后能整塊脫落，冷凍工藝較佳。從圖1中看出，PNS-LCN形態(tài)圓整，分散性良好，粒徑分布較均勻。

2．2 粒徑及分布、表面電位的測(cè)定 分別取凍干PNS-LCN溶液適量，以雙蒸水適當(dāng)稀釋后，采用馬爾文納米粒度分析儀、Zeta電位儀分別測(cè)定納米粒溶液的平均粒徑及粒徑分布、Zeta電位。結(jié)果見圖2。

圖2 三七皂苷長(zhǎng)循環(huán)納米粒粒徑(A)及電位(B)分布圖Fig．2 Particle size(A)and Zeta potential(B)distribution of PNS-LCN

從圖2(A)中可以看出，三七皂苷納米粒平均粒徑及分散系數(shù)分別為(147．667±4．497)nm、(0．267±0．042)，其 PNS-LCN 粒徑較小且分布較窄。通常長(zhǎng)循環(huán)納米粒的平均粒徑在100～250 nm之間時(shí)可以避免MPS系統(tǒng)的吞噬，而達(dá)到更好的長(zhǎng)循環(huán)效果，小于150 nm的納米粒靶向骨髓，小于250 nm的納米粒靶向體循環(huán)［6］。從圖2(B)中可以看出，Zeta電位為(－44．70±1．47)mV，Zeta電位絕對(duì)大于30 mV。一般認(rèn)為［7］Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV時(shí)，體系是穩(wěn)定的。

2．3 差示掃描量熱(DSC)分析 以空Al2O3坩鍋為參比，另一Al2O3坩鍋放入樣品，升溫速度10℃/min，掃描范圍30～250℃。結(jié)果見圖3。

圖3 各物質(zhì)的DSC圖譜Fig．3 DSC curves

從圖3中可以看出，當(dāng)溫度超過140℃時(shí)，大豆卵磷脂發(fā)生分解，出現(xiàn)多個(gè)分解峰，這些峰在物理混合物和PNS-LCN中均觀察不到，可能是由于峰值較小，被其他物質(zhì)掩蓋;PEG-PLGA為共聚物，在掃描范圍30～250℃內(nèi)沒有明顯的吸收峰;膽固醇在152℃的吸收峰、甘露醇在177℃吸收峰、殼聚糖在120℃吸收峰及三七皂苷在105℃的吸收峰均在物理混合物中出現(xiàn)，物理混合物的DSC圖譜具有膽固醇、甘露醇、殼聚糖和三七皂苷的譜線疊加的特征，說明物理混合后各物質(zhì)之間未發(fā)生物理化學(xué)變化;在PNS-LCN的DSC圖譜中，膽固醇、甘露醇、殼聚糖、三七皂苷的特征吸收峰均消失，且在172℃出現(xiàn)新的吸收峰，表明各物質(zhì)之間發(fā)生了相互作用，可能有新的物相生成。

2．4 紅外光譜(IR)分析 樣品的紅外光譜(IR)測(cè)定采用EQUINOX55型紅外光譜儀，每個(gè)樣品的紅外光譜為500～4 000 cm－1范圍內(nèi)掃描16次的累積。紅外光譜圖見圖4。

從圖4中可以看出，大豆卵磷脂在2 882、1 803 cm－1的吸收峰、膽固醇在 3 443、2 885、1 702、1 453、1 396 cm－1的吸收峰、MPEG-PLGA 在 1 793 cm－1的吸收峰及PNS在3 442、2 886 cm－1的吸收峰在物理混合中均存在，說明物理混合后各物質(zhì)未發(fā)生物理化學(xué)變化。比較物理混合和納米粒的紅外光譜，膽固醇、PNS位于3 443 cm－1吸收峰在物理混合中吸收較強(qiáng)，而在納米粒中則較弱;膽固醇、PNS位于2 886 cm－1吸收峰在物理混合中出現(xiàn)，而在納米粒中吸收峰消失，這種吸收強(qiáng)度的變化、吸收峰的消失等，說明各物質(zhì)之間發(fā)生了分子間作用。

圖4 各物質(zhì)的紅外光譜分析Fig．4 IR spectra

2．5 X射線衍射(XRD)分析 樣品的X射線衍射分析在D/Max-3c型X射線衍射儀上進(jìn)行，掃描范圍2θ為:3°～65°Cu Kα 靶，管電壓60 kV，管電流30 mA，采樣間隔為0．02°。X-ray分析見圖5。

圖5 各物質(zhì)的XRD圖譜Fig．5 X-ray diffraction patterns

從圖5中可以看出，大豆卵磷脂、殼聚糖、MPEG-PLGA和PNS沒有顯著的衍射峰，只有非晶峰，這些非晶峰較小，在物理混合物中被其它物質(zhì)的衍射峰掩蓋;膽固醇在5°和甘露醇的全部衍射峰均在物理混合物中出現(xiàn)，物理混合物的X-ray圖譜具有膽固醇和甘露醇的譜線疊加的特征。對(duì)比圖5(7)和(8)，可以看出PNS-LCN和物理混合物的的主要特征峰明顯不同，PNS-LCN相對(duì)于物理混合，晶體衍射峰減少，2θ為 11°、15°、18°、23．5°、29°等晶體峰消失，且在 2θ為 9°、25°、28°、41°均出現(xiàn)新的晶體衍射峰，表明PNS-LCN中有新的晶型生成?？瞻准{米粒衍射譜相對(duì)于物理混合其晶體衍射峰的強(qiáng)度減弱，這說明除了PNS，各輔料之間也發(fā)生分子間的作用;比較空白納米粒和載藥納米粒衍射譜，載藥納米等晶體峰消失，且出現(xiàn)新的晶體衍射峰，這表明PNS不是簡(jiǎn)單的作為模型藥物，而且其在納米粒形成的過程中與各輔料之間發(fā)生了分子間的作用，并改變物料的性質(zhì)。

2．6 體外溶出度考察

2．6．1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(4．6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水，其梯度洗脫條件為:0～15 min，乙腈由20%線性增加到21．5%，15～36 min，乙腈由21．5%線性遞增到40%;體積流量:1．0 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm。

2．6．2 液相色譜系統(tǒng)的可行性驗(yàn)證 按2．1項(xiàng)方法分別制備空白納米粒和載藥納米粒，按色譜條件測(cè)定，色譜圖見圖6?？瞻准{米粒中無干擾三七總皂苷測(cè)定的物質(zhì)，表明該色譜系統(tǒng)適用于三七總皂苷的測(cè)定。

2．6．3 體外溶出 采用透析法，精密移取PNS溶液、PNS-LCN溶液，分別裝入已處理好的透析袋中，將透析袋兩端扎緊，置于200 mL pH7．4磷酸鹽緩沖溶液［8］中，保持漏槽狀態(tài)，容器口密閉，恒溫(37±1)℃，恒速(100 r/min)攪拌，定時(shí)取樣0．5 mL，同時(shí)補(bǔ)加同體積同溫度的釋放介質(zhì)，平行3份。從所取樣品中取10μL進(jìn)樣，計(jì)算累積釋藥量。結(jié)果見圖7。

PNS-LCN在前12 h內(nèi)的釋放的速度比較快，這是因?yàn)榧{米粒周圍游離的三七皂苷所致，12 h之后藥物的釋放速度比較緩慢，這可能與聚合物骨架材料的降解速度有關(guān)。

2．6．4 模型擬合 PNS和PNS-LCN在達(dá)到釋放平衡時(shí)間內(nèi)，將釋放時(shí)間(t)與藥物的累積溶出百分率(Q)分別用零級(jí)釋放模型、一級(jí)釋放模型、Weibull模型和Higuchi模型進(jìn)行擬合［9］，結(jié)果見表1。

2．6．5 溶出數(shù)據(jù)分析 從表1中可以看出，PNS、PNS-LCN均為Weibull模型擬合較好。根據(jù)威布爾分布函數(shù)的處理方法，計(jì)算PNS的T50、TD分別為3．59 h、6．07 h;PNS-LCN T50、TD分別為 11．27 h、20．31 h。PNS、PNS-LCN 溶出參數(shù) T50、TD值比較均有顯著性差異(P＜0．01)，表明三七皂苷制成納米粒之后其內(nèi)在質(zhì)量產(chǎn)生較大差異。

圖6 高效液相色譜圖Fig．6 HPLC chromatograms

圖7 PNS、PNS-LCN體外釋放曲線(n=3)Fig．7 Release curves of PNS and PNS-LCN(n=3)

表1 三七皂苷納米粒溶出數(shù)據(jù)的擬合方程Tab．1 The fitting equations of release date of PNS-LCN

3 討論

結(jié)合IR、DSC和XRD的分析結(jié)果，表明PNSLCN中殼聚糖、PEG-PLGA等和PNS之間發(fā)生了分子間作用，有新的物相即新晶形生成。

PNS-LCN具有明顯的緩釋作用，PNS的體外釋藥參數(shù) T50、TD分別延長(zhǎng)了約3．13倍和3．34倍。結(jié)果說明MPEG-PLGA長(zhǎng)循環(huán)納米粒有望在緩釋和控釋給藥系統(tǒng)中獲得重要的應(yīng)用。

本研究采用 TEM、IR、DSC、XRD、釋放度等多種表征手段，對(duì)PNS-LCN的理化性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為三七皂苷納米粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)及鑒定提供試驗(yàn)依據(jù)和納米制劑學(xué)研究和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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