播散性隱球菌病1例及其實驗研究

冉夢龍 魯巧云 涂平 萬喆 楊淑霞 吳艷 李若瑜 王愛平

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，北京 100034)

隱球菌病(cryptococcosis)主要是由新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)和格特隱球菌 (C.gattii)感染而引起的疾?。?］。2008年我們曾經(jīng)報道過1例肝移植后由新生隱球菌grubii變種引起的播散性隱球菌?。?］。最近我科又確診1例由新生隱球菌grubii變種引起的播散性隱球菌病，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

患者男，72歲。因軀干、四肢皮損1年2個月，伴雙下肢結(jié)節(jié)、潰爛6個月于2009年12月1日收住我科?；颊咴?年2個月前雙下肢出現(xiàn)散在性分布的紅色斑疹，逐漸泛發(fā)至軀干及上肢，融合成片，皮損不高出皮面，伴輕度瘙癢。在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院取活檢診斷為“濕疹”，給予口服中藥治療稍好轉(zhuǎn)。9個月前軀干、四肢皮損再次加重，且出現(xiàn)了腋窩及腹股溝淋巴結(jié)腫大，再次在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院取活檢診斷為“紅皮病”，血常規(guī)顯示有嗜酸細胞增多，給予患者口服醋酸潑尼松40 mg/d治療，軀干、四肢皮損明顯減輕，腋窩及腹股溝腫大淋巴結(jié)消退，醋酸潑尼松逐漸減量至15 mg/d維持治療。6個月前，患者的右大腿外側(cè)、左小腿外側(cè)及臀部相繼出現(xiàn)一些結(jié)節(jié)，逐漸增大，表面破潰后結(jié)痂，無膿液。3個月前軀干、四肢皮損又加重，且原紅色斑疹突出皮面，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院對兩種表現(xiàn)不同的皮損又進行了活檢，對軀干部原有皮損活檢診斷為“蕈樣肉芽腫早期”，對下肢結(jié)節(jié)性皮損診斷為“黃瘤病”?；颊呃^續(xù)口服醋酸潑尼松15 mg/d治療，同時肌注α-2b干擾素300萬單位，每周兩次，軀干、四肢皮損大部分消退，但下肢結(jié)節(jié)潰爛性皮損無改變。為進一步診治于2009年11月30日就診我科門診，對患者所帶組織病理片會診提示1種皮損表現(xiàn)為苔蘚樣浸潤，1種皮損表現(xiàn)為組織細胞肉芽腫改變，可見酵母細胞，考慮“真菌感染，紅皮病緩解期”收入院。發(fā)病以來，患者伴咳嗽，少量咳痰，無胸痛、發(fā)熱、頭痛、頭暈，精神有時稍萎靡，飲食及兩便未見明顯異常。否認有系統(tǒng)疾病史?；颊呔镁觾?nèi)蒙古呼和浩特市，無養(yǎng)鴿史，居住地附近有花鳥市場，否認有密切接觸禽類史。

體格檢查:體溫36.2℃，呼吸20次/min，脈搏84次/min，血壓120/70 mmHg。全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，心、肺、腹及神經(jīng)系統(tǒng)檢查未見明顯異常。皮膚科情況:軀干、四肢皮膚淡暗紅斑、干燥、脫屑，雙下肢伸側(cè)皮膚可見魚鱗病樣皮損改變。右大腿外則、左小腿外側(cè)、臀部各見1個直徑約2 cm的結(jié)節(jié)性皮損，質(zhì)韌，表面破潰結(jié)痂，無膿液 (見圖1)。實驗室檢查:血白細胞 6.85×109/L，分類正常;血紅蛋白134 g/L;血小板163×109/L。血沉21 mm/h，尿常規(guī)及血生化全項檢查未見異常，血RPR及HIV檢查陰性。淋巴細胞免疫表型檢查顯示總T淋巴細胞76%，總B淋巴細胞5%，T輔助淋巴細胞22%(正常27% ～51%)，T抑制淋巴細胞55%(正常 14% ～44%)，總 NK淋巴細胞17%，T 淋巴細胞 H/S比值0.4(正常0.7 ～2.8)，淋巴細胞總數(shù)98%。對患者結(jié)節(jié)性皮損取活檢顯示，表皮呈銀屑病樣增生，灶狀海綿水腫，角化不全，有膿痂;真皮淺中層片狀致密炎癥細胞浸潤，部分區(qū)域大量組織細胞和多核巨細胞，胞漿內(nèi)和細胞間見多數(shù)囊樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)有大小不一的酵母樣孢子，間有淋巴細胞，漿細胞浸潤 (見圖2～3)。結(jié)節(jié)性皮損組織同時進行真菌培養(yǎng)，顯示有酵母樣菌落，后經(jīng)生化和分子生物學(xué)鑒定為新生隱球菌生長(見圖4)。藥敏試驗顯示氟康唑MIC為2 μg/mL，5-氟胞嘧啶為≤4 μg/mL，伊曲康唑為 0.125 μg/mL，伏立康唑為0.06 μg/mL，兩性霉素 B 為≤0.5 μg/mL，均顯示為敏感。血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗為陽性 (++++);血清GM試驗陰性，G試驗陰性。胸片顯示雙肺紋理清晰，左側(cè)第2前肋肺野內(nèi)帶可見一結(jié)節(jié)影，邊緣模糊，提示左肺上葉結(jié)節(jié)性質(zhì)待定。胸部CT顯示左肺下葉后基底段胸膜下見大小約56 mm×37 mm×75 mm軟組織密度灶，其內(nèi)見直徑約30 mm含氣空內(nèi)有氣液平面，病灶周圍見多發(fā)索條狀影與胸膜相連。左肺下葉背段胸膜下見軟組織密度結(jié)節(jié)灶，雙肺肺尖纖維硬結(jié)灶，部分病灶呈軟組織密度灶，左上肺見索條影與側(cè)胸膜相連，左肺上葉可見含氣小囊影。提示左下肺后基底段空洞性病灶，考慮真菌性肺炎伴空洞形成，兩肺尖陳舊結(jié)核，部分增殖灶(見圖5～6)。3次痰真菌培養(yǎng)均為陰性。頭顱MRI平掃顯示雙側(cè)額、顳、頂葉灰白質(zhì)交界區(qū)異常信號，腦梗塞及缺血改變可能大，雙側(cè)白質(zhì)脫髓鞘，右側(cè)外囊、枕葉軟化灶?；颊呔芙^腰穿故未行腦脊液檢查。

診斷:播散性隱球菌病，紅皮病。明確診斷后，患者停服醋酸潑尼松，首日給予患者兩性霉素B 1 mg靜滴，次日2.5 mg，第3日5 mg，在第4日給予7.5 mg靜滴時患者出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)，遂停用兩性霉素B。換用氟康唑400 mg/d靜滴治療2周，結(jié)節(jié)性皮損明顯縮小，之后給予氟康唑300 mg/d口服治療。期間繼續(xù)肌注α-2b干擾素300萬單位，每周兩次。4周時再次復(fù)查血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗為陽性 (++++)，患者出院繼續(xù)前述治療。3個月后復(fù)診，軀干、四肢皮膚干燥伴脫屑，下肢結(jié)節(jié)性皮損全部消退。復(fù)查胸片顯示左肺陳舊性病變。血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗陽性 (++)。10個月后復(fù)診，血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗陽性 (++)。15個月復(fù)診，軀干、四肢皮膚干燥伴脫屑。胸片顯示雙肺紋理增多，左中上肺野少量索條影，呈左肺陳舊病變。腦MRI復(fù)查顯示腦內(nèi)多發(fā)缺血、梗塞;老年性腦改變;雙側(cè)上頜竇、篩竇炎。血清隱球菌抗原乳膠凝集試驗仍陽性(++)。整個治療期間患者無服藥不適感，定期復(fù)查血生化全項正常，血常規(guī)白細胞計數(shù)正常，但嗜酸粒細胞增多為27.11%，嗜酸粒細胞計數(shù)為2.28×109/L?；颊咭呀?jīng)完成15個月的治療，建議停用氟康唑和α-2b干擾素肌注，繼續(xù)隨訪血清隱球菌抗原乳膠凝集試驗。

圖1 下肢結(jié)節(jié) 圖2 表皮呈銀屑病樣增生，真皮淺中層致密炎癥細胞浸潤(HE，×40) 圖3 病理見大量真菌成分(HE，×400) 圖4 SDA培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)可見白色酵母樣菌落，尿素酶試驗陽性 圖5～6 左下肺后基底段空洞性病灶Fig.1 Nodule on the limb Fig.2 Psoriasis-like hyperplasia of epidermis，dense infiltration of inflammatory cells in the superficial and middle dermis(HE，×40)Fig.3 Plenty of fungal components in pathology(HE，×400)Fig.4 White yeast-like colonies on the SDA medium and positive urease test Fig.5-6 Pulmonary cavity in the posterior basal segment of the left lung

1.2 培養(yǎng)物進行菌種鑒定

皮損組織接種于不含放線菌酮的沙氏(SDA)培養(yǎng)基和尿素液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3 d后查看菌落形態(tài)。尿素液體培養(yǎng)基的配制方法如下:蛋白胨 0.1 g，氯化鈉 0.5 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，尿素 0.2 g，葡萄糖 0.01 g，H2O 100 mL，酚紅0.4 mL。將尿素外的其他藥品放入水中煮沸溶解，配成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將 pH值調(diào)至7.2，15磅高壓滅菌15 min。然后配制尿素溶液濾過滅菌，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻后后加入。

1.3 DNA提取、擴增及測序

DNA的提取按照 Makimura等的方法進行。用接種針挑取少量菌體 (一環(huán))，置于一已滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi);加入100 μL裂解液 (100 mmol/L Tris-Hcl，30 mmol/L EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15P 滅菌30 min 備用);100℃ 水浴15 min;加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀后，置于冰上30 min至1 h;在4℃下13 000 r/min離心5 min，上清夜移至一新1.5 mL離心管內(nèi);加入等體積的氯仿-異戊醇 (24∶1)，劇烈振蕩后，13 000 r/min，離心 15 min，移取上清夜至另一滅菌的1.5 mL的離心管內(nèi);重復(fù)上一步，直到兩相之間沒有沉淀，將上清液移至另一滅菌的0.5 mL的離心管內(nèi);加入等體積的冷的異丙醇，放置在-20℃靜置15 min;13 000 r/min離心15 min;用100 μL 70%的乙醇洗滌沉淀;將沉淀置于真空干燥器中抽干或者室溫干燥;加入50 μL已滅菌的蒸餾水，溶解;放于-20℃冷藏備用。

PCR體系及擴增條件如下，PCR體系 (25 μL):包括PuReTaq Ready-To-GoTMPCR Beads(GE Healthcare，貨號 27-9559-01)，內(nèi)含 200 mmol/L dNTP，10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2以及 2.5 U PuReTaq DNA聚合酶。加入上游引物和下游引物各1 μL，模板1 μL以及蒸餾水22 μL。使用真菌通用引物ITS5 5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ＇和 ITS4 5 ＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇，目的產(chǎn)物片段大小為463 bp。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性，30 s;54℃退火，30 s;72℃，延伸 1 min;循環(huán)35次，72℃，后延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送交華大基因公司進行測序。

2 結(jié) 果

皮損組織在SDA培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)可見白色酵母樣菌落，尿素酶試驗陽性(葡萄酒樣紅色)(見圖4)。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到了預(yù)期的一條約463 bp大小的目的片段 (見圖7)。將測序所得的序列輸入互聯(lián)網(wǎng)美國國立衛(wèi)生研究院全國生物技術(shù)中心 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST生物序列同源性數(shù)據(jù)庫，檢索序列相似性。發(fā)現(xiàn)它和新生隱球菌grubii變種(FJ534879.1)的一致性為100%。因此，該菌株被鑒定為新生隱球菌grubii變種。

3 討 論

新生隱球菌有2個變種，新生隱球菌grubii變種 (C.neoformansvar.grubii)和新生隱球菌新生變種 (C.neoformansvar.neoformans)。新生隱球菌grubii變種為血清A型，世界性分布。在鳥糞中最常被分離出，在鴿子糞便中分離率最高。此外，在腐敗的蔬菜、水果和水果汁、木材、牛奶制品和土壤中也可分離出。新生隱球菌新生變種為血清D型，多流行于法國、意大利和丹麥等歐洲國家，更常見于老年人、皮膚感染和使用糖皮質(zhì)激素者。格特隱球菌為血清B型和C型，分布更局限，主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)，多感染免疫力正常人群，肺和腦常受累［1］。

皮膚隱球菌病根據(jù)感染來源分為原發(fā)性和繼發(fā)性感染兩種。原發(fā)性感染往往獨立存在，但也可播散到其他部位，發(fā)病前大多具有局部外傷史，一般預(yù)后較好。繼發(fā)性感染一般預(yù)示已經(jīng)發(fā)生播散性隱球菌感染，主要來源于血行播散，提示感染嚴(yán)重。皮膚隱球菌感染的皮損多種多樣，最常見傳染性軟疣樣帶有臍凹的損害，也可表現(xiàn)為潰瘍、結(jié)節(jié)、膿皰、紅斑、壞死以及蜂窩織炎等損害［3］。診斷需要根據(jù)發(fā)病部位、皮損類型、患者的免疫功能、皮膚病理以及真菌學(xué)檢查結(jié)果，最后確診依賴于皮損真菌培養(yǎng)有隱球菌生長和(或)皮損的組織病理發(fā)現(xiàn)有莢膜的孢子［3］。一旦確診為皮膚隱球菌病，就進行肺、腦脊液以及血液學(xué)檢查，以區(qū)分是原發(fā)性還是繼發(fā)性皮膚感染［3］。該患者為老年男性，有基礎(chǔ)疾病紅皮病，口服醋酸潑尼松治療，血淋巴細胞免疫表型檢查顯示T輔助淋巴細胞比例下降，T抑制淋巴細胞比例升高。皮損呈結(jié)節(jié)潰爛，散在分布于下肢和臀部，皮損組織病理中可見有莢膜的酵母細胞，皮損真菌培養(yǎng)為新生隱球菌grubii變種，皮膚隱球菌病診斷成立?；颊咝夭緾T可見空洞性病灶，同時存在肺隱球菌病;血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗陽性，因此，皮膚隱球菌病屬于繼發(fā)性，最后確診為播散性隱球菌病。

圖7 PCR擴增產(chǎn)物(463 bp大小的目的片段) 圖8 治療3個月后皮損消退Fig.7 A 463 bp fragment identified by PCR Fig.8 Lesion resolved after 3-month treatment

繼發(fā)性皮膚隱球菌感染需要按照中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的原則進行治療，對于非HIV相關(guān)的推薦治療方案，誘導(dǎo)治療采用兩性霉素B 0.5～1 mg·kg-1·d-1聯(lián)合氟胞嘧啶100 mg·kg-1·d-1至少8周，鞏固治療采用氟康唑或伊曲康唑200～400 mg/d治療12周［3］。該患者不能耐受兩性霉素B的治療，故一直口服氟康唑300 mg/d治療，3個月后皮損消退，肺部損害呈陳舊性病變，血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗陽性(++)(見圖8)。但治療15個月后復(fù)查血清隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗仍陽性(++)。檢測血清乳膠凝集試驗判斷療效，只要經(jīng)積極治療抗原滴度會下降［4］，但血清乳膠凝集試驗持續(xù)陽性不能作為維持治療的指標(biāo)［3］。當(dāng)真菌鏡檢和培養(yǎng)全部轉(zhuǎn)陰時，其結(jié)果仍呈陽性，最低滴度為1∶40，可能因為死亡的隱球菌仍持續(xù)釋放莢膜多糖抗原，而腦脊液中清除此類抗原緩慢的緣故［5］。黃紹萍等［6］隨訪8例患者血清乳膠凝集試驗陽性持續(xù)時間分別為2～12個月，3例患者病灶在3～5個月內(nèi)消失，其余病例病灶吸收較慢，隨訪12個月病灶均未完全消失。基于上述情況，我們囑患者停止用藥，繼續(xù)隨訪血清學(xué)試驗。

皮膚隱球菌病的組織病理主要由大量繁殖的隱球菌及其引起的炎性細胞浸潤構(gòu)成。皮損可以顯示膠樣液化，囊腔內(nèi)有多量酵母細胞;亦可表現(xiàn)為肉芽腫形成，主要由單核細胞、上皮樣細胞和多核巨細胞等構(gòu)成，此時酵母細胞數(shù)目較少，且大部分被吞噬細胞吞入胞漿內(nèi)。在較新鮮的病灶內(nèi)，酵母細胞大小不等，小的居多，且容易見到單芽生孢子。在其他病灶內(nèi)，酵母細胞較大，很少見芽生狀態(tài)。HE染色酵母細胞胞壁淡藍或淡紅色，莢膜不著色;PAS染色酵母細胞呈紅色;GMS染色呈黑色;粘卡紅蛋白染色呈紅色;阿申藍染色呈藍色［7］。組織病理有時易與黃瘤病混淆，只要做特殊染色就可以鑒別。該患者的組織病理在外院就曾誤診為黃瘤病，因此，需要提高臨床醫(yī)生對真菌性皮膚病的認識。

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