肺癌患者淋巴細(xì)胞亞群在外周血中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

羅君 凌志強(qiáng) 毛偉敏

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，5年生存率僅有10%-15%。近年研究發(fā)現(xiàn)肺癌常伴有免疫機(jī)能紊亂，許多研究[1-4]報道了免疫細(xì)胞亞群與臨床病理學(xué)資料之間的關(guān)系，卻鮮見外周血免疫學(xué)指標(biāo)與預(yù)后關(guān)系的闡述。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)，根據(jù)白細(xì)胞表面抗原分化群（clusters of differentiation, CD）對淋巴細(xì)胞亞群的分類來檢測肺癌首診患者外周血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD25+、CD44+及NK細(xì)胞，以正常參考值做對照，結(jié)合臨床病理及隨訪資料進(jìn)行分析，旨在探討淋巴細(xì)胞亞群與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2006年8月-2007年12月在浙江省腫瘤醫(yī)院住院治療的221例肺癌首診患者資料，所有研究病例均經(jīng)纖維支氣管鏡或腫塊穿刺活檢明確診斷為肺癌，并且抽血化驗(yàn)前均未行放療、化療或手術(shù)，排除嚴(yán)重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。年齡33歲-83歲，男性175例，女性46例，中位年齡59歲。181例患者接受了含鉑類兩藥聯(lián)合化療，其中78例患者在化療后3周-4周再次抽血復(fù)查。96例健康成年人作為對照組，選自本院體檢健康人群，年齡性別均與檢測組匹配。對全部肺癌患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪截止日期為2010年12月10日，其中失訪18例，失訪者在生存分析中以最近一次隨訪日期作為截尾值處理。

1.2 腫瘤分期及分化程度 腫瘤分期根據(jù)纖維支氣管鏡、胸部CT、B超等檢查結(jié)果，采用國際抗癌聯(lián)盟（international union against cancer, UICC）2002年肺癌第六版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）188例：包括I期8例、II期7例、III期80例、IV期84例、無分期資料9例；小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）33例。低分化、未分化124例，高分化、中分化及高中分化24例，分化程度未知73例。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測

1.3.1 標(biāo)本采集 221例患者和96例健康對照組于入院治療或體檢之前清晨空腹抽靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）鉀鹽抗凝。獲得標(biāo)本后立即送檢。

1.3.2 試劑和儀器 采用美國Becton Dickinson公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀和配套的淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒（Smultest IMK-Lymphocyte），試劑盒中的雙色熒光抗體為異硫氰酸熒光素和藻紅蛋白標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體（catalog No.340182）。

1.3.3 三色免疫熒光染色 采集血液2 mL，肝素抗凝，2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。流式試管內(nèi)加相應(yīng)單抗20 μL，加入肝素抗凝的待測血漿100 μL，混勻后室溫避光30 min充分反應(yīng)。加2 mL溶血素2次，震蕩混勻，室溫避光5 min，1,200 rpm離心5 min，去上清后加磷酸鹽緩沖液震蕩混勻，1,200 rpm離心5 min，倒去上清，加固定液300 μL震蕩混勻。

1.3.4 流式細(xì)胞儀分析 使用Couter公司配套的System II系統(tǒng)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。進(jìn)行光路流路的較準(zhǔn)后再進(jìn)行熒光補(bǔ)償，最后行樣本檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 檢測結(jié)果以Mean±SD表示。利用SPSS 17.0分析試驗(yàn)結(jié)果，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、配對t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、生存分析等方法分析數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例資料分析結(jié)果 與健康對照組相比，肺癌患者淋巴細(xì)胞亞群除CD4+外的7項(xiàng)指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中CD3+及CD8+明顯低于健康對照組，CD4+/CD8+比值、NK細(xì)胞、CD19+、CD25+及CD44+明顯高于健康對照組（表1）。與NSCLC相比，SCLC的CD8+明顯升高而CD4+和CD4+/CD8+比值明顯下降（P＜0.05）。NSCLC中I/II期與III/IV期相比、肺癌患者低/未分化與中/高分化相比，淋巴細(xì)胞亞群的8項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

2.2 化療相關(guān)的隨訪資料分析結(jié)果 化療前后相比，肺癌患者淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD19+、CD44+及NK細(xì)胞這4項(xiàng)指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中化療后CD3+明顯上升，NK細(xì)胞、CD19+及CD44+明顯下降（表3）?；熀驝D44+升高組29人，未升高組49人，Kaplan-Meier分析提示化療后CD44+表達(dá)不升高者有生存優(yōu)勢（P=0.021），而其余3項(xiàng)指標(biāo)與患者預(yù)期生存無關(guān)（P＞0.05）（表4，圖1）?；熀驝D44+升高組（69.45±17.89）與未升高組（46.45±18.33）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.01），但兩組的性別、年齡、吸煙史、飲酒史和家族史相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。COX回歸分析顯示化療后CD44+表達(dá)不升高者有獨(dú)立的生存優(yōu)勢（RR=1.863,95%CI: 1.063-3.261, P=0.03），其余3項(xiàng)指標(biāo)與患者預(yù)期生存無關(guān)（P＞0.05）。

表 1 肺癌患者與健康人外周血淋巴細(xì)胞亞群的對比Tab 1 Contrast of lymphocyte subsets in peripheral blood between lung cancer patients and healthy control group

表 2 肺癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between lymphocyte subsets in peripheral blood and clinicopathologic

表 3 肺癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群在化療前后的對比（n=78）Tab 3 Contrast of lymphocyte subsets in peripheral blood between pre-chemotherapy and post-chemotherapy (n=78)

表 4 化療后上升組與未上升組的生存期對比Tab 4 Contrast of survival times between increase group and un-increase group after chemotherapy

圖 1 CD44+生存曲線顯示化療后CD44+表達(dá)未升高者有生存優(yōu)勢（P=0.021）Fig 1 Survival curve of CD44+ showed the patients with un-increase of CD44+ after chemotherapy had more survival opportunities (P=0.021)

3 討論

一般認(rèn)為具有免疫功能的淋巴細(xì)胞大致可分為T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。CD3+總T細(xì)胞分為CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞的表面抗原有CD19和CD20，NK自然殺傷細(xì)胞的表面抗原包括CD16、CD56，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面抗原有CD25（白介素2受體），而CD44為粘附分子。

3.1 肺癌外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化 在正常機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞免疫、體液免疫和固有免疫系統(tǒng)維持著相互間平衡的關(guān)系。腫瘤患者往往都伴有免疫功能的抑制或紊亂。許多研究[1-4]在腫瘤患者體內(nèi)觀察到CD8+、CD25+及NK細(xì)胞升高，CD4+、CD4+/CD8+比值及CD19+降低的現(xiàn)象，而本研究卻發(fā)現(xiàn)CD8+下降，CD4+/CD8+比值、CD25+、NK細(xì)胞和CD19+上升。CD8+T細(xì)胞被公認(rèn)為是抗腫瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞則被認(rèn)為與機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫有關(guān)。肺癌患者外周血中觀察到CD8+T細(xì)胞下降的現(xiàn)象，可能是由于腫瘤細(xì)胞在特有的免疫逃逸機(jī)制作用下，改變了其表面特異性受體的結(jié)構(gòu)，使效應(yīng)性T細(xì)胞無法正確識別和結(jié)合其靶點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖被反饋性抑制。而此時非特異性免疫和體液免疫所占的比例相對上升，因此NK細(xì)胞和CD19+細(xì)胞升高。CD4+T細(xì)胞較健康組雖然有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故CD4+/CD8+比值相應(yīng)升高。

筆者認(rèn)為腫瘤患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群的比例并非一成不變。Osada等[5]曾報道過胃癌患者外周血中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞均下降的現(xiàn)象。而Patel等[6]總結(jié)人類乳頭瘤病毒的免疫逃避機(jī)制時提出CD4+細(xì)胞在早期的宮頸上皮內(nèi)瘤變中占主要地位，CD8+細(xì)胞在進(jìn)展期宮頸癌中占主要地位。可見在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，隨著免疫微環(huán)境的改變，各淋巴細(xì)胞亞群的比例也會隨之變化，需多因子聯(lián)合檢測才能完整反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。

本研究還比較了不同分期、不同分化程度肺癌外周血淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)上述8項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NSCLC和SCLC相比CD8+、CD4+和CD4+/CD8+比值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。王亞娟等[7]曾報道CD4+及CD4+/CD8+比值在肺鱗癌和未分化癌間存在差異，而其它指標(biāo)與分期及病理類型無相關(guān)性。這一結(jié)果與本研究結(jié)果基本相符。3.2 肺癌外周血淋巴細(xì)胞亞群與化療及預(yù)后的關(guān)系 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，體液免疫和固有免疫為輔。本研究證明化療后代表細(xì)胞免疫的CD3+T細(xì)胞升高，而代表體液免疫和固有免疫的CD19+細(xì)胞、NK細(xì)胞降低。該結(jié)果需要從兩方面考慮，一方面可能提示化療對機(jī)體免疫系統(tǒng)具有優(yōu)化作用，能活化抗腫瘤免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)，誘使機(jī)體免疫應(yīng)答朝向正向發(fā)展；另一方面化療藥物的非選擇性殺傷作用，對增殖活躍的淋巴細(xì)胞也有影響[2]。我們采用的檢測方法僅能得到各淋巴細(xì)胞的相對比例，并不能分析其絕對值，因此也可能是化療對體液免疫和固有免疫系統(tǒng)的損傷作用超過了細(xì)胞免疫，使CD3+總T細(xì)胞的比例相對升高?？梢?，目前的檢測方法并不能很好地評價化療對腫瘤免疫的影響，尚待深入研究。

CD44是一種分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，屬于細(xì)胞黏附分子。其正常功能是參與淋巴細(xì)胞的激活，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的歸巢、淋巴細(xì)胞向炎癥部位和黏膜相關(guān)淋巴組織歸位、黏附細(xì)胞外基質(zhì)等。近年來發(fā)現(xiàn)，CD44分子在許多惡性腫瘤組織中高表達(dá)[8,9]，但在外周血中的表達(dá)卻并非完全一致[10,11]，這可能與不同種類腫瘤的侵襲性不同有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血中CD44+的表達(dá)較健康人明顯升高，而化療后下降，并且在對化療相關(guān)的淋巴細(xì)胞亞群的生存分析結(jié)果提示化療后CD44+表達(dá)不升高者有生存優(yōu)勢（P=0.021），而其他3項(xiàng)指標(biāo)則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且此作用與患者性別、年齡、生活習(xí)慣（抽煙及飲酒史）等因素?zé)o關(guān)。以上證據(jù)提示CD44+是肺癌的危險因素之一，其升高可能與治療后預(yù)后不良有關(guān)，Lin等[12]在頭頸部腫瘤研究中也有類似報道。

抗腫瘤免疫是整個免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用，各種免疫細(xì)胞會隨著免疫狀態(tài)的改變而發(fā)生變化，聯(lián)合多因子檢測才能較完整的反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也引起免疫系統(tǒng)的改變，對于這種改變的評價還需進(jìn)一步探討。同時，本研究發(fā)現(xiàn)CD44粘附分子在化療后的改變與生存時間有關(guān)，有望為臨床診療提供一些幫助。