冬凌草醇提物腹腔注射給藥急性毒性試驗*

蔣征奎，楊正武，王隨華，李寅超，劉宏民，郭 琰，吳翠萍，劉學武，趙宜紅，高珊珊

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，河南鄭州450003;2.西峽縣米萍鄉(xiāng)衛(wèi)生院，河南西峽474598;3.鄭州大學藥學院，河南 鄭州450052)

冬凌草［Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara.］系唇形科植物碎米椏的干燥全草，又名冰凌花，為河南區(qū)域特色中藥，味甘、苦，性微寒，有清熱解毒、活血止痛功能［1］。目前，冬凌草作為治療食管癌與賁門癌的特效中草藥已被國內中醫(yī)藥界認可。冬凌草醇提物對體外培養(yǎng)的HeLa細胞和食管癌細胞均有一定的細胞毒作用，也能抑制各種動物腫瘤的生長［1］。前期本課題組對冬凌草醇提物灌胃給藥的急性毒性進行了研究［2］，為進一步明確其安全性，又開展了冬凌草醇提物對小鼠單次腹腔注射(ip)給藥的毒性實驗。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠94只，雌雄各半，體質量(20±2)g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(豫)2005－0001，動物質量合格證號為0003857。飼料、飲水、墊料均符合衛(wèi)生標準。小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學藥學院SPF級實驗動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK(豫)2007－0009。小鼠實驗前先喂養(yǎng)1周，為適應期。

1.2 藥物與試劑

冬凌草(碎米椏)采集于河南省濟源市山區(qū)，經鄭州大學藥學院劉若庸教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物碎米椏Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara.。冬凌草醇提物由鄭州大學新藥研發(fā)中心制備，每克冬凌草醇提物相當于冬凌草原生藥材21.71 g;放置于4℃冰箱備用，用前以大豆油(供注射用)配成所需濃度的混懸液。大豆油，供注射用，購于江西金海棠藥用油有限公司批號2008701。

1.3 預試驗

1.3.1 首次預試驗

取12只小鼠，按體質量、性別分層隨機法分為3組，每組4只，雌雄各半。冬凌草醇提物劑量等比級數(shù)1∶0.5。分別為:預試 1 組(590 μg/g)、預試2 組(295 μg/g)、預試 3 組(148 μg/g)。禁食(不禁水)12 h后，各組均按20 μL/g的容量 ip 1次，給藥后記錄動物的即時反應并連續(xù)觀察7 d。結果不能確定小鼠死亡率(P)為0%的劑量(Dn)，因此須進行二次預實驗以確定。結果見表1。

1.3.2 二次預試驗

本次預試驗所取動物數(shù)、分組數(shù)、各組ip容量等均同前，劑量等比級數(shù)為1∶0.5，分別為:預試1組(295 μg/g)、預 試 2 組 (148 μg/g)、預 試 3 組(75 μg/g)。禁食(不禁水)12 h后，1次 ip給藥，然后觀察記錄動物的即時反應，連續(xù)觀察7 d。結果見表1。

1.3.3結果

綜合兩次預試驗結果，以295 μg/g的劑量 ip后，P=1;以 75 μg/g 的劑量 ip 后，P=0。由此，本實驗確定冬凌草醇提物最大給藥劑量(Dmax)約為295 μg/g，最小給藥劑量(Dmin)約為 75 μg/g。

1.4 正式試驗

根據上述預實驗結果，按Bliss法設計，在Dmax(295 μg/g)～ Dmin(75 μg/g)的劑量(含 Dmax和Dmin)范圍內設6個劑量組，根據文獻［3］公式計算得到劑量比值為0.76。取70只小鼠，適應性飼養(yǎng)7 d后，按體質量、性別分層隨機法分為7組，每組10只，雌雄各半。冬凌草醇提物劑量等比級數(shù)為1∶0.76，給藥 1 ～6 組的劑量依次為 295，224，170，130，99，75 μg/g;空白對照組給予等容積的溶媒(即注射用大豆油)。禁食(不禁水)12 h后，各組均按20 μL/g一次性ip，給藥后記錄動物的即時反應。連續(xù)觀察14 d，記錄動物毒性反應出現(xiàn)時間及恢復時間、死亡情況以及死亡分布時間，并分別于給藥前和給藥后第7，14 d稱量存活動物體質量。死亡或瀕死動物及時進行尸檢。

表1 兩次預試驗的劑量及小鼠的死亡率

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 小鼠一般狀況觀察

單次腹腔注射不同劑量的冬凌草醇提物后，多數(shù)動物即時呈現(xiàn)扭體、伏臥、豎毛、精神萎靡等異常癥狀。隨時間推移，大部分存活動物出現(xiàn)行動遲緩、眼睛有分泌物、體形消瘦、肛周污穢等癥狀。給藥劑量不同，存活動物異常癥狀恢復的時間有所差異:給藥3組和4組存活小鼠在4 d后、給藥5組和6組存活小鼠在2 d后，異常癥狀開始趨向恢復。給藥劑量不同，動物死亡分布時間也有所差異:給藥1組和2組動物在給藥后1～3 h死亡，給藥3組動物在給藥后3～5 h死亡，給藥4組動物在給藥后3～10 d死亡。大部分動物死前出現(xiàn)掙扎、張口、呼吸困難癥狀，個別動物出現(xiàn)角弓反張等。對死亡或瀕死小鼠立即行尸體解剖，裸眼下觀察發(fā)現(xiàn)，心、肝、腎、肺、腦、脾、胸腺等重要器官均無明顯異常，但多數(shù)動物十二指腸充血。對存活小鼠連續(xù)觀察14 d，結果動物一般情況良好，未見其他毒性反應出現(xiàn)。14 d后對存活小鼠行尸體解剖，裸眼下觀察心、肝、腎、肺、腦、脾、胸腺等重要器官，發(fā)現(xiàn)給藥3組和4組存活小鼠呈現(xiàn)肝臟邊緣略鈍厚、少數(shù)有與腹腔膜粘連現(xiàn)象，余未有明顯異常發(fā)現(xiàn)。

2.2 各組小鼠體質量變化

給藥1組和2組動物在給藥后1 d內全部死亡，其余各組存活小鼠給藥第7，14 d的體質量見圖1。各給藥組存活小鼠的體質量與空白對照組對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.3 LD50的計算

實驗完畢，將所得數(shù)據(見表2)用Bliss法求得冬凌草醇提物 ip給藥的 LD50為148.71 μg/g，其95%可信限為130.56～169.47 μg/g。急性毒性正式試驗的各組給藥劑量與小鼠死亡率見表2。

圖1 各組小鼠體質量增長情況

表2 急性毒性正式試驗的各組給藥劑量與小鼠死亡率對比

3 討論

在預試驗中，冬凌草醇提物對小鼠的0%(Dmin)劑量和100%(Dmax)致死劑量分別為75 μg/g 和 295 μg/g。正式試驗時，最小給藥劑量99 mg/g得到了與預試驗相同的0%死亡率，而在給藥劑量為224 mg/g時即得到了100%死亡率。因此，在計算 LD50時采用的 Dmax為224 mg/g、Dmin為99 mg/g。因冬凌草醇提物在水或食用油中溶解性較差，經反復試驗，確定將冬凌草醇提物經真空冷凍干燥后研粉，均勻混懸于注射用大豆油中用于實驗。

中藥毒性與LD50呈負相關［4］。前期本課題組按Bliss法設計測得冬凌草醇提物灌胃給藥的LD50為1.992 3 mg/g，按含生藥量計算約為43.25 mg/g［2］。本實驗進一步觀察了冬凌草醇提物腹腔注射給予小鼠的急性毒性反應，結果顯示，冬凌草醇提物ip給藥的LD50為0.148 71 mg/g，按含生藥量計算約為3.23 mg/g。有文獻［5］認為，大毒中藥 LD50＜5 g/kg，有毒中藥 LD50介于5～15 g/kg，小毒中藥 LD50介于16～50 g/kg，無毒中藥 LD50＞50 g/kg。若以這種尚不完善的粗略的中藥毒性分級方法判定，冬凌草醇提物灌胃給藥毒性甚小，腹腔注射給藥則毒性相對較大。

值得注意的是，急性毒性試驗不只是LD50的測定，急性毒性試驗結果僅提供LD50值是不夠的。試驗期間詳細記錄動物的毒性反應情況和死亡動物分布，尤其是中毒和死亡的發(fā)生時間、毒性反應的持續(xù)時間和恢復時間是十分必要的［5］。本實驗結果顯示:冬凌草醇提物給藥劑量不同，存活動物異常癥狀恢復的時間和動物死亡分布時間均有所差異;給藥后的各組存活小鼠第7天及第14天的體質量與空白對照組對比，呈平行增長，差別無統(tǒng)計學意義。尸體解剖發(fā)現(xiàn)，部分小鼠十二指腸色紅充血。筆者考慮此與冬凌草具有活血作用［1］、冬凌草甲素可能有舒張外周血管的作用［6］有關，推測中毒劑量的冬凌草醇提物腹腔注射可能引起十二指腸黏膜水腫和充血而引發(fā)炎癥反應。此外，本實驗中給藥3組和4組存活小鼠呈現(xiàn)肝臟邊緣略鈍厚、少數(shù)有與腹腔膜粘連現(xiàn)象，推測可能與腹腔注射對肝臟產生影響有關，此尚待進一步研究。

［1］侯士良.中藥八百味詳解［M］.鄭州:河南科學技術出版社，2009:204－205.

［2］菅衛(wèi)中，王隨華，李寅超，等.冬凌草醇提取物單次灌胃給藥毒性試驗［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2010，31(23):139－142.

［3］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:112.

［4］李寅超，趙宜紅.辛夷揮發(fā)油半數(shù)致死量(LD50)的測定［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2009，29(21):1885－1886.

［5］關建紅，翁維良.對中藥“毒性”與毒性分級的思考［J］.中國中藥雜志，2008，33(4):485 －487.

［6］李琦，劉潔，陳正.冬凌草甲素對家兔血流動力學的影響及其機理研究［J］.白求恩醫(yī)科大學學報，1994，20(2):128－129.