肺癌組織中RKIP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)觀察

齊 戰(zhàn)，楊大運(yùn)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族，參與對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、G蛋白偶聯(lián)受體和NF-κΒ 信號通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)［1，2］RKIP 在多種腫瘤中呈低表達(dá)或表達(dá)缺失，被作為是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。2009～2011年，我們采用RTPCR和甲基化特異性PCR(MSP)法觀察肺癌組織與相應(yīng)癌旁肺組織中RKIP基因表達(dá)情況及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，分析RKIP基因表達(dá)及其甲基化狀態(tài)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 83例新鮮肺癌手術(shù)標(biāo)本(每例分別取癌組織及癌旁正常組織)，均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。男48例，女35例;年齡33～75歲，平均53.7歲。其中吸煙(吸煙＞5支/d、連續(xù)＞2 a)者43例，非吸煙者40例。臨床分期:Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期45例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例，無轉(zhuǎn)移者40例。標(biāo)本均于術(shù)中離體0.5 h內(nèi)取材，立即置入液氮速凍罐中，于－80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RKIP基因及其甲基化率檢測方法

1.2.1 RKIP基因 采用 RT-PCR法。用 Trizol一步法抽提肺癌及癌旁正常肺組織中總RNA，經(jīng)DNA酶消化后逆轉(zhuǎn)錄，行PCR擴(kuò)增。引物序列為RKIP:上游引物5'-GAATAGACCCACCAGCAT-3'，下游引物5'-CGTAAACCAGCCAGACAT-3';GAPDH:上游引物5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC G-3'，下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'。RKIP擴(kuò)增條件:95 ℃ 3 min，94℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30 個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 5 min，4℃終止，擴(kuò)增片段長度為236 bp。取5 μl產(chǎn)物加1 μl溴酚藍(lán)，經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.2 DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾 采用蛋白酶K-苯酚抽提法提取肺癌及癌旁肺組織中總DNA［3］紫外分光光度計(jì)檢測總DNA含量和純度(A260/A280＞1.8)，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。亞硫酸氫鹽處理修飾，用DNA純化試劑盒純化(按說明書操作)后，將DNA重懸于50 μl水中，水浴、沉淀、回收、干燥后，重懸于50 μl水中，－20℃用箔包裹保存。用正常人外周血淋巴細(xì)胞抽提的DNA行亞硫酸氫鹽處理后作為未甲基化對照;正常人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)SssⅠ甲基化酶處理后再經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾作為甲基化對照。陰性對照用水代替模板DNA進(jìn)行PCR。

1.2.3 RKIP基因甲基化狀態(tài)檢測 用 MSP法。引物設(shè)計(jì)根據(jù)RKIP基因序列，并參照文獻(xiàn)［4］的方法合成。RKIP甲基化引物序列:上游引物:5'-TTTAGCGATATTTTTTGAGATACGA-3'，下游引物:5'-GCTCCCTAACCTCTAATTAACCG-3'，擴(kuò)增片段 204 bp;未甲基化對照引物序列:上游引物:5'-TTTAGTGATATTTTTTGAGATATGA-3';下游引物:5'-CACTCCCTAACCTCTAATTAACCAA-3'，擴(kuò) 增 片 段205 bp。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min，加入 Taq-DNA 聚合酶后，94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min(4℃保存)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶。將單純出現(xiàn)甲基化條帶者確定為甲基化;將單純出現(xiàn)非甲基化條帶或同時(shí)出現(xiàn)非甲基化條帶和甲基化條帶者確定為非甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)。α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肺癌、癌旁組織中RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比較 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測見一特異擴(kuò)增條帶，其分子量大小與預(yù)期結(jié)果相符。肺癌組織中RKIP基因陽性表達(dá)率為44.6%(37/83)，明顯低于癌旁正常組織中的61.4%(51/83)，P ＜0.05;肺癌組織中 RKIP 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為45.8%(38/83)，明顯高于癌旁組織中的13.3%(11/83)，P ＜0.05。

2.2 RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、病理分型無關(guān)，而與肺癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者生存時(shí)間有關(guān)。詳見表1。

表1 RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

RKIP基因定位于人12號染色體q24.22，含4個(gè)外顯子，編碼由187個(gè)氨基酸組成的蛋白。RKIP參與對ERK/MAPK、G蛋白偶聯(lián)受體和NF-κB信號通路的調(diào)控［5，6］。研究表明［1，2］，RKIP 在許多腫瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等組織中表達(dá)減少或缺失，但具體機(jī)制尚不明確。有學(xué)者［4］對82例大腸癌標(biāo)本檢測RKIP啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)現(xiàn)，完全不表達(dá)RKIP的腫瘤中，有72.5%顯示RKIP啟動(dòng)子甲基化，與RKIP表達(dá)減少或缺失一致，認(rèn)為RKIP啟動(dòng)子中CpG島甲基化是RKIP沉默的主要機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中RKIP基因陽性表達(dá)率與癌旁組織比較顯著下降，提示RKIP基因表達(dá)減少發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，其表達(dá)缺失與肺癌發(fā)生有關(guān)。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期＜2 a者的肺癌組織中RKIP基因表達(dá)陽性率均低于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期≥2 a者，提示RKIP基因表達(dá)減少與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中RKIP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率顯著高于癌旁組織。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期＜2 a者的肺癌組織中RKIP基因甲基化頻率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期≥2 a者，提示RKIP基因甲基化狀態(tài)與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。

我們初步認(rèn)為，肺癌中甲基化的RKIP基因失表達(dá)率顯著高于該基因未甲基化的癌組織，提示RKIP基因表達(dá)缺失與肺癌發(fā)生有關(guān)，且RKIP發(fā)生異常甲基化是其表達(dá)缺失的原因。

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