齊 戰(zhàn),楊大運(yùn)
(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院,石家莊 050011)
Raf激酶抑制蛋白(RKIP)屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族,參與對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、G蛋白偶聯(lián)受體和NF-κΒ 信號通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)[1,2]RKIP 在多種腫瘤中呈低表達(dá)或表達(dá)缺失,被作為是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。2009~2011年,我們采用RTPCR和甲基化特異性PCR(MSP)法觀察肺癌組織與相應(yīng)癌旁肺組織中RKIP基因表達(dá)情況及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),分析RKIP基因表達(dá)及其甲基化狀態(tài)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。
1.1 研究對象 83例新鮮肺癌手術(shù)標(biāo)本(每例分別取癌組織及癌旁正常組織),均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。男48例,女35例;年齡33~75歲,平均53.7歲。其中吸煙(吸煙>5支/d、連續(xù)>2 a)者43例,非吸煙者40例。臨床分期:Ⅰ+Ⅱ期38例,Ⅲ+Ⅳ期45例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例,無轉(zhuǎn)移者40例。標(biāo)本均于術(shù)中離體0.5 h內(nèi)取材,立即置入液氮速凍罐中,于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 RKIP基因及其甲基化率檢測方法
1.2.1 RKIP基因 采用 RT-PCR法。用 Trizol一步法抽提肺癌及癌旁正常肺組織中總RNA,經(jīng)DNA酶消化后逆轉(zhuǎn)錄,行PCR擴(kuò)增。引物序列為RKIP:上游引物5'-GAATAGACCCACCAGCAT-3',下游引物5'-CGTAAACCAGCCAGACAT-3';GAPDH:上游引物5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC G-3',下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'。RKIP擴(kuò)增條件:95 ℃ 3 min,94℃ 45 s,53 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30 個(gè)循環(huán),延伸72℃ 5 min,4℃終止,擴(kuò)增片段長度為236 bp。取5 μl產(chǎn)物加1 μl溴酚藍(lán),經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
1.2.2 DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾 采用蛋白酶K-苯酚抽提法提取肺癌及癌旁肺組織中總DNA[3]紫外分光光度計(jì)檢測總DNA含量和純度(A260/A280>1.8),瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。亞硫酸氫鹽處理修飾,用DNA純化試劑盒純化(按說明書操作)后,將DNA重懸于50 μl水中,水浴、沉淀、回收、干燥后,重懸于50 μl水中,-20℃用箔包裹保存。用正常人外周血淋巴細(xì)胞抽提的DNA行亞硫酸氫鹽處理后作為未甲基化對照;正常人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)SssⅠ甲基化酶處理后再經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾作為甲基化對照。陰性對照用水代替模板DNA進(jìn)行PCR。
1.2.3 RKIP基因甲基化狀態(tài)檢測 用 MSP法。引物設(shè)計(jì)根據(jù)RKIP基因序列,并參照文獻(xiàn)[4]的方法合成。RKIP甲基化引物序列:上游引物:5'-TTTAGCGATATTTTTTGAGATACGA-3',下游引物:5'-GCTCCCTAACCTCTAATTAACCG-3',擴(kuò)增片段 204 bp;未甲基化對照引物序列:上游引物:5'-TTTAGTGATATTTTTTGAGATATGA-3';下游引物:5'-CACTCCCTAACCTCTAATTAACCAA-3',擴(kuò) 增 片 段205 bp。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min,加入 Taq-DNA 聚合酶后,94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸5 min(4℃保存)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶。將單純出現(xiàn)甲基化條帶者確定為甲基化;將單純出現(xiàn)非甲基化條帶或同時(shí)出現(xiàn)非甲基化條帶和甲基化條帶者確定為非甲基化。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)。α=0.05。
2.1 肺癌、癌旁組織中RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比較 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測見一特異擴(kuò)增條帶,其分子量大小與預(yù)期結(jié)果相符。肺癌組織中RKIP基因陽性表達(dá)率為44.6%(37/83),明顯低于癌旁正常組織中的61.4%(51/83),P <0.05;肺癌組織中 RKIP 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為45.8%(38/83),明顯高于癌旁組織中的13.3%(11/83),P <0.05。
2.2 RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、病理分型無關(guān),而與肺癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者生存時(shí)間有關(guān)。詳見表1。
表1 RKIP基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與肺癌臨床病理特征的關(guān)系
RKIP基因定位于人12號染色體q24.22,含4個(gè)外顯子,編碼由187個(gè)氨基酸組成的蛋白。RKIP參與對ERK/MAPK、G蛋白偶聯(lián)受體和NF-κB信號通路的調(diào)控[5,6]。研究表明[1,2],RKIP 在許多腫瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等組織中表達(dá)減少或缺失,但具體機(jī)制尚不明確。有學(xué)者[4]對82例大腸癌標(biāo)本檢測RKIP啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)現(xiàn),完全不表達(dá)RKIP的腫瘤中,有72.5%顯示RKIP啟動(dòng)子甲基化,與RKIP表達(dá)減少或缺失一致,認(rèn)為RKIP啟動(dòng)子中CpG島甲基化是RKIP沉默的主要機(jī)制。
本研究發(fā)現(xiàn),肺癌組織中RKIP基因陽性表達(dá)率與癌旁組織比較顯著下降,提示RKIP基因表達(dá)減少發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,其表達(dá)缺失與肺癌發(fā)生有關(guān)。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期<2 a者的肺癌組織中RKIP基因表達(dá)陽性率均低于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期≥2 a者,提示RKIP基因表達(dá)減少與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。
本研究還發(fā)現(xiàn),肺癌組織中RKIP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率顯著高于癌旁組織。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期<2 a者的肺癌組織中RKIP基因甲基化頻率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期≥2 a者,提示RKIP基因甲基化狀態(tài)與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。
我們初步認(rèn)為,肺癌中甲基化的RKIP基因失表達(dá)率顯著高于該基因未甲基化的癌組織,提示RKIP基因表達(dá)缺失與肺癌發(fā)生有關(guān),且RKIP發(fā)生異常甲基化是其表達(dá)缺失的原因。
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