實驗室新鮮血液防腐劑使用方法探索

劉衛(wèi)東

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000）

我們實驗室是1998年由生理學(xué)、藥理學(xué)、病理生理學(xué)三學(xué)科的實驗室合并而成，目前主要承擔(dān)生理學(xué)、藥理學(xué)和一部分病理學(xué)的實驗教學(xué)任務(wù)。實驗教學(xué)工作中大量使用活體動植物及其生鮮制品，比如小白鼠、血液制品、皂苷等，這些物品在使用過程中容易受到細(xì)菌污染及空氣中的氧氣氧化等因素的影響，造成物質(zhì)損耗，并造成實驗現(xiàn)象改變，影響教學(xué)效果［1］。為了延長物品的使用時間，節(jié)約實驗成本，往往需要使用一些有防腐、保鮮作用的物質(zhì)。我國在食品和藥品中允許使用的防腐劑有32種，但是常用的防腐劑主要有苯甲酸和苯甲酸鈉、山梨酸和山梨酸鈉、丙酸鈣、乳酸鏈球菌素等等，而在實驗室中，由于為非食用用途，因此一些非食用類物質(zhì)也可以當(dāng)作防腐劑來使用，比如甲醛、氟化鈉等。這些物質(zhì)的使用可以參照國家食品、藥品管理規(guī)定中有關(guān)防腐劑、保鮮劑的相關(guān)規(guī)定，但更多的需要在實踐中逐步摸索。我們對于一些常見的非食用類物質(zhì)對血液的防腐的影響通過實驗進(jìn)行了觀測。

作為有重要生理功能的血液及其制品在多個實驗項目中都要用到，血液成分十分復(fù)雜，在實驗中可以分為血漿組成和性質(zhì)實驗、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分類實驗、血液功能實驗等。不同實驗中對防腐均有不同的要求，比如血紅蛋白結(jié)合氧的實驗和一氧化碳毒性實驗中只需要保護(hù)血紅蛋白部分不改變活性［2］，同時盡量保護(hù)紅細(xì)胞的形態(tài)，而對于血漿成分的要求不高，只要不發(fā)生明顯的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象干擾實驗就可以了。由于商業(yè)血液制品中已經(jīng)含有一定量的防腐劑，但一般僅限于開封之前在生產(chǎn)、運輸和保存過程中的防腐，如果開封后不能立即用完，或?qū)嶒炇椰F(xiàn)采的血液，均需要加入一些防腐劑。

由于蛋白質(zhì)是血液功能的主要承載者，也是比較容易受到細(xì)菌作用而變質(zhì)的部分，因此我們主要研究防腐劑對血液中蛋白質(zhì)的影響。由于血紅蛋白的含量較高，且在多個實驗項目中都有應(yīng)用，我們選擇血紅蛋白進(jìn)行測試，但直接測定血紅蛋白有困難，而CO與血紅蛋白結(jié)合后有比較強的紫外吸收，可以根據(jù)吸光系數(shù)的變化判斷血紅蛋白是否已經(jīng)變質(zhì)［3］。我們選擇了實驗室中常用的甲醛、氟化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、亞硝酸鈉、草酸鉀、肝素鈉、檸檬酸鉀及氟化鈉與草酸鉀混合物（1：3）8種試劑，按常用濃度分別添加到血樣品中，并于添加后的0 h、2 h、8 h、24 h、3 d、7 d用紫外可見光分光光度法檢測其中Hb-CO飽和度。本實驗所用的所有藥品均為分析純。所用的濃度：10%甲醛1：9（體積濃度），氟化鈉8 mg/mL，乙二胺四乙酸鈉2 mg/mL，亞硝酸鈉0.15mg/mL，草酸鉀2 mg/mL，肝素鈉200 IU/mL，氟化鈉和草酸鉀（1：3）混合液4 mg/mL，檸檬酸納5 mg/mL。

1 實驗方法

1.1 飽和HbCO血液樣本制作 取500 mL新鮮血液，向其中緩慢通入甲酸與濃硫酸共熱［4］產(chǎn)生的CO 30 min，制成被CO飽和的血液，此時血液呈櫻桃紅色，再向血樣中通入10 min N2，用來帶出多余的CO，然后取同一血液樣本將飽和血稀釋至需要的濃度。

1.2 樣本處理與檢測 設(shè)添加組和空白對照組共9組樣品，在室溫下用安瓿瓶存放在陽光無法直射處，分別保存0 h，2 h，8 h，24 h，3 d和7 d時間下在533 nm處檢測其摩爾吸光系數(shù)，并計算各組血樣中Hb-CO的相對飽和度。

1.3 工作曲線的繪制 將完全飽和CO的血液的HbCO飽和度視為100%，按體積比配制成理論Hb-CO飽和度分別為5%、10%、20%、40%、60%、80%、100% 的濃度系列，用上述方法檢測得實測值，利用理論值與實測值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果

2.1 顏色變化 通入CO的血液因HbCO的生成而顯櫻桃紅色，隨著通氣時間的延長，HbCO飽和度增加，櫻桃紅色逐漸趨于明顯，通氣約25m in后櫻桃紅色趨于穩(wěn)定且不再變化。實驗血樣加入氟化鈉后櫻桃紅色變得鮮艷，到7d，血液變成暗紅色；加入氟化鈉：草酸鉀（1：3），血液顏色變得鮮艷；加入亞硝酸鈉血液變?yōu)榘岛稚?，似醬油狀；加入甲醛、乙二胺四乙酸二鈉、草酸鉀、肝素鈉、檸檬酸鉀血液櫻桃紅色變化不明顯，7d后變?yōu)榘导t色。

2.2 HbCO飽和度穩(wěn)定性檢驗 將空白血樣0h時的摩爾吸光系數(shù)為基準(zhǔn)值，其他樣品測得的數(shù)值為相對數(shù)值，每份樣品均測定5次，求算術(shù)平均值，結(jié)果均保留小數(shù)點后一位［6］，檢驗結(jié)果見表1。

表1 各時間段HbCO飽和度平均值

3 討論

從空白對照血樣的數(shù)據(jù)看，血液腐敗在最初的兩小時內(nèi)比較慢，此后迅速加快，8 h后即明顯變質(zhì)。由于實驗用樣品開封后一般在一天內(nèi)做完，因此最有價值的防腐作用是在2～8 h內(nèi)抑制樣品的腐敗變質(zhì)。氟化鈉是一種強效代謝抑制劑，氟離子可以與多種蛋白結(jié)合，并能抑制琥珀酸脫氫酶，致使氧化作用下降，影響細(xì)胞呼吸功能并造成一部分紅細(xì)胞解體。這可能是加入氟化鈉后血液變的更加鮮紅的原因，從數(shù)據(jù)上看加入氟化鈉后吸光系數(shù)略微增大，且基本保持穩(wěn)定，說明氟化鈉的加入明顯的抑制了樣品的腐敗過程，尤其是在最初的1 d時間內(nèi)，效果很顯著。

甲醛是一種毒性較強的物質(zhì)，可以與血紅蛋白中的鐵離子作用，使吸光系數(shù)發(fā)生明顯變化［7］。甲醛是原漿毒，可與蛋白質(zhì)、氨基酸及核酸發(fā)生烷化、甲基化等使蛋白質(zhì)凝固，形成不溶物沉淀，從而降低機體內(nèi)氨基酸、核酸的濃度，并對測試有一定的干擾，經(jīng)過離心后仍對實驗有一定影響。

亞硝酸鈉中的N為+3價，同時具有氧化性和還原性，可以氧化血紅蛋白中的二價鐵離子為三價的高鐵離子，使血液變?yōu)榘岛稚?，并使吸光系?shù)發(fā)生較大改變。同時亞硝酸鈉毒性較強，對細(xì)胞代謝有較大的影響，使用后對實驗干擾嚴(yán)重［8］。

草酸鉀、肝素鈉、檸檬酸鈉的變化曲線與空白對照血樣的變化曲線的形狀很接近，但變化比較緩和，說明其對抑制血樣的變質(zhì)作用比較溫和，且沒有改變血液腐敗的歷程，僅僅讓腐敗的過程有所減緩。

綜上所述，甲醛和亞硝酸鈉在血液的防腐方面是最不適宜的，會對血樣造成明顯的破壞；草酸鉀、肝素鈉、檸檬酸鈉均為較緩和的防腐劑，對血液中的蛋白不會造成明顯的影響；氟化鈉及其含氟化鈉的混合物對抑制蛋白質(zhì)的變質(zhì)有明顯的作用，但對某些酶可能有較強的破壞作用［9］。

［1］ 馬曉璇，李汶.防腐劑的定量測定方法概況［J］.今日藥學(xué)，2008，18（2）：24-28.

［2］ 李義龍，單戰(zhàn)海，韓冰,等.酶法糖化血紅蛋白試劑盒方法學(xué)比對評價［J］.中國實驗診斷學(xué)，2010，14（8）：1336-1338.

［3］ 張高勤，張大明，宋朝錦,等.血液樣品中防腐劑對碳氧血紅蛋白穩(wěn)定性的影響［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（1）：20-23.

［4］ 陳潔，李潤琪.環(huán)保型一氧化碳?xì)怏w發(fā)生裝置［J］.分析儀器，2006，(1)：58-59.

［5］ 湯其寧，郝敬貢，夏青.甲醛染毒對大鼠子代臟器及血液細(xì)胞的 影響［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2006，23（1）：56-58.

［6］ 沈高山，谷懷民，閆天秀,等.亞硝酸鈉和氧合血紅蛋白反應(yīng)的拉曼光譜［J］.中國激光，2008，35（9）：1432-1436.

［7］ 雷霆雯，吳青青.氟化鈉對小鼠肝臟細(xì)胞色素P4501A1酶活性的影響［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，35（4）：355-357.