一株分解纖維素放線菌的誘變選育及其固態(tài)發(fā)酵條件

倪 林， 李春葆， 李世艷， 胡士明， 葉 明

（1.合肥工業(yè)大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.恰恰食品股份有限公司，安徽 合肥 230031；3.安徽九牛飼料有限公司，安徽 合肥 230031）

纖維素是地球上最豐富的自然資源，也是一種可再生的能源物質，利用生物轉化技術可將其轉化成多種低分子物質。為了更好地利用纖維素，國內外學者很早就開始關注纖維素酶的研究與應用［1］。然而，目前用于纖維素酶生產的菌株所產纖維素酶的酶活均不高，不能滿足生產實踐的需要，如芽孢桿菌的CMCase酶活最高達14.59μmol／min［2］。因此，篩選高效纖維素分解菌，確立相應的纖維素酶發(fā)酵工藝條件顯得尤為重要。本研究在廣泛搜集實驗材料的基礎上，希望能分離篩選一株出高產纖維素酶菌株，再對其進行微波－硫酸二乙酯復合誘變，并運用正交試驗法對突變菌株進行固態(tài)發(fā)酵條件研究，以期為纖維素酶的開發(fā)應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

分離自合肥工業(yè)大學南區(qū)排污口土壤。

1.2 培養(yǎng)基

初篩平板培養(yǎng)基和CMC－Na復篩培養(yǎng)基［3－4］。其營養(yǎng)鹽固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為：不同發(fā)酵底物（稻草粉、稻殼粉、麩皮和濾紙粉）15g，加入營養(yǎng)鹽溶液的組成為：（NH4）2SO410g／L、KH2PO43g／L、CaCl20.5g／L、MgSO40.5g／L。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離篩選

以初篩分離培養(yǎng)基進行初篩，CMC－Na培養(yǎng)基和剛果紅染色復篩。

1.3.2 菌株的鑒定

依據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《細菌和放線菌的鑒定》進行初步鑒定。

1.3.3 誘變選育

（1）微波－硫酸二乙酯復合誘變。參見文獻［5］所述方法制備菌懸液，調微波爐功率為700W，脈沖頻率為450MHz。按0、10、20、30、40、50、60s不同的處理時間，對孢子懸液進行處理，然后取出1mL進行適當稀釋，得到不同稀釋度的菌懸液。稀釋后吸取0.1mL菌懸液涂布于均勻涂有硫酸二乙酯的CMC－Na培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4d。挑取誘變后長勢較好的突變菌落，分別接種到CMC－Na培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)4d，進行菌落計數，根據對照平板上的菌落數，計算不同處理時間的致死率為：

通過測定透明圈與菌落直徑大小進行復篩，從中挑選高產菌株。

（2）菌株復篩。挑取初篩得到的產酶菌株斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基上，用無菌玻璃棒壓碎與培養(yǎng)基攪勻，28℃恒溫培養(yǎng)3d后進行酶活測定，突變株與對照菌株比較，相對酶活≤90%的為負突變株，相對酶活≥110%的為正突變株，相對酶活在90%～110%的為等性突變株，計算正突變率。

1.3.4 產酶條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，確定本次正交試驗的因素和水平。以L16（45）正交表來設計試驗，不考慮各因素間的交互作用，因素水平見表1所列。

表1 正交試驗因素水平

按固體取干重的10倍加入蒸餾水攪拌，于40 ℃ 水浴中保溫 45min。4000r／min 離心20min，上清液即為粗酶液，測定其CMC酶活、天然纖維素酶活和FPA酶活。

1.3.5 纖維素酶活力測定

（1）CMC酶活的測定。于25mL具塞試管中加入質量分數為1%、pH值為4.8的CMCNa－醋酸緩沖液1.8mL，加入0.2mL酶液，50℃保溫30min后，加入3.0mL DNS試劑，水浴煮沸5min，冷卻后用蒸餾水定容，搖勻，于540nm處測定吸光度值［2］。

（2）天然纖維素酶活的測定。于25mL具塞試管中加入pH值為4.8的醋酸緩沖液1.8mL、天然纖維素50.0mg以及酶液0.2mL，50℃保溫24h后，其他的同CMC酶活的測定［6］。

（3）FPA酶活的測定。于25mL具塞試管中加入pH值為4.8的醋酸緩沖液1.8mL、50.0 mg新華濾紙以及酶液0.2mL，50℃保溫60min后，其他的同CMC酶活的測定［7］。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

XWC8菌株的菌落呈圓環(huán)形生長，放射狀，中間稍隆起，顏色正反面不一致，正面為白色，反面為棕黃色，有土腥味。菌絲有基內菌絲和氣生菌絲的分化，氣生菌絲較細 （直徑為0.8～1.0μm），無分隔多分枝，革蘭氏染色陽性；孢子絲螺旋形，孢子球形（直徑為0.7μm），無孢囊，形成孢子后覆蓋菌落表層呈粉狀，雪白色單個孢子球形，無鞭毛。氣生菌絲體白色，絲絨狀，在菌落邊緣生長成同心圓，在以纖維素為基質的培養(yǎng)基上生長良好。根據細菌和放線菌的鑒定手冊初步確定菌株XWC8屬于放線菌屬（Actinomyces）。

2.2 微波－硫酸二乙酯復合誘變

取0.1mL誘變后的菌懸液，涂布于均勻涂有硫酸二乙酯的CMC－Na培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4d，誘變致死率曲線如圖1所示。

從圖1可看出，當誘變劑量一定時，隨著處理時間的增加，孢子的死亡率逐漸升高，微波處理50s，致死率達98.1%，處理60s時孢子致死率高達99.2%。這說明XWC8的孢子對微波－硫酸二乙酯較敏感。

2.3 纖維素酶高產菌株的篩選

測定CMC－Na復篩平板上透明圈與菌落直徑大小，并計算相對酶活，結果見表2所列。

表2 突變菌株的CMC－Na相對酶活

隨著微波輻射時間的延長，正突變率突變株也隨之增加。當輻射時間為40s時正突變率最高，達47.2%。這可能是由于被微波輻射極性分子在電磁場中快速轉向產生相互摩擦，引起胞子懸浮液溫度迅速升高；輻射超過50s，孢子的致死率高達98.1%，且正突變率迅速下降。XWC8－d的CMC－Na相對酶活為0.920cm／d，較原始菌株XWC8提高了47.2%，因此以XWC8－d作為下一步產酶優(yōu)化的出發(fā)菌株。

2.4 菌株產酶條件優(yōu)化

2.4.1 正交試驗結果

由于試驗結果為多種酶活，而實際應用中各酶活重要性相當，所以采用綜合評分法對實驗數據進行分析，計算各評價指標的隸屬度，繼而相加得到綜合分，將多指標轉化為單指標進行直觀分析，結果見表3所列。

根據極差R值及Ki可得最優(yōu)組合為A3B1C1D1E1，且誘變菌株XWC8－d產纖維素酶的最顯著影響因素為碳源，其次為培養(yǎng)溫度，含水量、培養(yǎng)時間及氮源影響依次減小。最佳固態(tài)發(fā)酵底物為麩皮，培養(yǎng)溫度為25℃時產酶酶活最高，產酶最佳固液比為1∶2.3，最佳培養(yǎng)時間為96h，氮源硝酸銨對產酶也有促進作用，當以硝酸銨為氮源時，產酶酶活達到最大，且硝酸銨為無機氮源較為經濟。

而由表3可看出，最優(yōu)處理組合為A3B2C4D3E1，這與綜合評分法所得的結果不一致，故需進行驗證性試驗。

表3 XWC8－d菌株正交試驗結果

續(xù)表

2.4.2 驗證試驗

對2組合方案A3B2C4D3E1和A3B1C1D1E1進行驗證試驗，結果見表4所列。

表4 驗證實驗結果 μmol／min

由表4可知，組合方案A3B1C1D1E1總體上優(yōu)于A3B2C4D3E1，故得到菌株XWC8－d的最佳產酶條件如下：麥麩為單一碳源，NH4NO3為氮源，固液比為1∶2.3，28℃下培養(yǎng)96h。比較突變菌株XWC8－d在該條件下和出發(fā)菌株XWC8在秸稈為單一碳源，硫酸銨作氮源［8］，固液比為1∶2.3，28℃下培養(yǎng)96h條件下的FPA酶活、天然纖維素酶活和CMC酶活，結果見表5所列。

表5 XWC8－d與XWC8在優(yōu)化條件下的酶活 μmol／min

由表5可知，在優(yōu)化條件下突變株XWC8－d的FPA酶活較原始菌株XWC8提高96.8%，CMC酶活提高102%，天然纖維素酶活提高189%。

3 結束語

目前，在國內關于放線菌分解纖維素的報道不多，本研究對篩選出的一株可分解纖維素的放線菌XWC8，首次進行了微波－硫酸二乙酯復合誘變，獲得突變株XWC8－d，并運用正交試驗法對XWC8－d進行固態(tài)發(fā)酵條件研究，確定了菌株XWC8－d的最優(yōu)產酶條件如下：碳源麥麩（15g），氮源為NH4NO3（0.3g），固液比為1∶2.3，25℃下培養(yǎng)96h。結果表明，XWC8－d生長的最適碳源為小麥加工的副產品麥麩。此外，該菌株還能夠很好地利用稻草和稻殼等秸稈纖維素，并將其降解為多種低分子物質，故該菌株具有良好的應用前景。

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