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    酒客樂對大鼠酒精性肝纖維化療效及機制的研究*

    2011-08-31 06:14:32甘愛萍李云橋陳宏慈
    關(guān)鍵詞:酒客模組酒精性

    甘愛萍 李云橋 陳宏慈

    1.湖北省中醫(yī)院綜合科 (湖北武漢,430061) 2.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院綜合科

    在我國隨著生活條件的改善及酒精消耗量的增多,酒精性肝損傷的發(fā)病亦在逐漸增多[1]。酒精性肝損傷,即酒精性肝病 (Alcoholic liver disease,ALD)是由于長期的過度飲酒所致的肝臟疾病。在臨床病理學(xué)上可將其分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化幾種基本類型[2],其中酒精性肝纖維化是發(fā)展到酒精性肝硬化的重要階段,是一個可逆過程[3,4]。因此研究其防治具有重要意義。筆者利用酒精性肝纖維化的大鼠模型,通過觀察中藥復(fù)方酒客樂對其體重、肝功能、肝纖維化血清學(xué)指標 [Ⅲ型前膠原氨基末端肽 (PⅢP)、層粘蛋白 (LN)]、肝臟表達 TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)水平以及病理學(xué)的影響,探討酒客樂對酒精性肝纖維化的防治作用及機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 純系Wistar清潔級雄性大白鼠,體重135~165g,由同濟醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供。

    1.1.2 飼料 普通大鼠飼料,由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供。

    1.1.3 藥物 酒客樂,由葛花、枳椇子、木瓜等藥 (購于湖北省中醫(yī)院藥房)組成,每劑首次加水350ml浸泡30分鐘后以文火煎煮30分鐘,濾出煎液,藥渣加3倍量水繼續(xù)煎煮20分鐘,合并兩次藥液,于水浴上濃縮制成1g/ml、3g/ml兩種提取液,過濾后4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.4 主要試劑 紅星二鍋頭白酒,55°,北京釀酒總廠生產(chǎn);吡唑,Sigma公司制造,批號:000218;橄欖油,購于湖北省醫(yī)藥公司;TGF-β1免疫組化染色試劑盒,批號:000712,DAB顯色試劑盒,產(chǎn)品批號:001022,均購于武漢博士德生物工程有限公司;PⅢP、LN試劑盒購于北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司;ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、AST(天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)試劑盒,購于武漢亞法生物技術(shù)有限公司。

    1.1.5 主要儀器設(shè)備 光鏡、Ts-RE自動脫水機、BM-Ⅲ型組織包埋機、AO切片機、CS-B型攤片烤片機、電子天平、H-600日立電鏡、離心機、HP.IAS-1000型全自動彩色圖像分析系統(tǒng)、721型分光光度計。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組與處理 40只大鼠隨機分為5組,每組8只。分別是:正常對照組 (簡稱正常組):正常飼料,自由飲水。造模組:灌胃白酒-橄欖油-吡唑混合液,酒的攝入量為8~12g·kg-1·d-1,隨時間的延長而遞增,橄欖油的攝入量為2g·kg-1·d-1;吡唑攝入量為24mg·kg-1·d-1。造模時間為12周。高劑量預(yù)防組:每天早晨 (7∶00-8∶00)灌胃白酒-橄欖油-吡唑混合液,2小時后灌胃1次3g/ml酒客樂煎劑,劑量為24g·kg-1·d-1。低劑量預(yù)防組:每天早晨 (7∶00-8∶00)灌胃白酒-橄欖油-吡唑混合液,2小時后灌胃1次1g/ml酒客樂煎劑,劑量為8g·kg-1·d-1。治療組:灌服白酒-橄欖油-吡唑混合液12周造模成功后用3g/ml酒客樂灌胃治療4周,劑量為24g·kg-1·d-1。

    以上藥物劑量根據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版,陳奇主編的《中藥藥理實驗方法》,按體型系數(shù)換算法求得 (低劑量相當于成人普通劑量,高劑量為成人普通劑量的3倍)。

    1.2.2 標本采集 ①血液 實驗第12周結(jié)束后,將大白鼠(除治療組外)用戊巴比妥鈉 (50mg/ml)腹腔注射麻醉后摘眼法取血,分離血清后于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。治療組大鼠于第16周結(jié)束后采集標本。②肝組織 采血后用脊椎脫臼法處死動物,打開腹腔,切取肝左葉組織 (大小約12mm×5mm×2mm),生理鹽水沖洗后將其浸入10%甲醛液固定用于光鏡觀察;切取肝右葉組織 (大小約1mm×1mm×1mm),立即將其浸入2.5%戊二醛中固定用于電鏡觀察。

    1.2.3 觀察指標及方法 一般情況,觀察大鼠飲水、攝食、活動狀態(tài)、精神狀態(tài)、營養(yǎng),早晚各1次;體重變化,每周測量1次;血清ALT、AST含量,采用賴氏法測定,具體操作嚴格按試劑盒說明書進行;血清PⅢP、LN含量,采用放射免疫法,同位素室專人測定;病理切片,常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡觀察,由湖北省中醫(yī)院病理科協(xié)助完成;肝臟超微結(jié)構(gòu)的改變,在透視電鏡下觀察;肝臟表達TGF-β1水平,采用SABC法:①載玻片防脫片劑處理,采用APES。撈片后置60℃烤箱30~60分鐘,以使切片緊密黏附。②常規(guī)石蠟切片,切片脫蠟。③蒸餾水新鮮配置3%H2O2,室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水洗2分鐘×3次。④滴加復(fù)合消化液,室溫10分鐘,0.1M PBS洗2分鐘×3次。⑤滴加山羊血清封閉液,室溫10分鐘,甩去多余液體,不洗。⑥滴加兔抗抗原,20℃,60分鐘,0.1M PBS洗2分鐘×3次。⑦滴加生物素化山羊抗兔 IgG,20℃ ~37℃,20分鐘,0.1M PBS洗2分鐘×3次。⑧滴加洗劑 SABC,20℃,20分鐘,0.1M PBS洗5分鐘 ×4次。⑨DAB顯色,使用 DAB顯色試劑盒(ED1012)。取1ml蒸餾水,加試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至切片,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,蒸餾水洗滌。⑩蘇木素輕度復(fù)染,脫水、透明、去脂、封片。

    顯微鏡觀察切片染成棕色的部位,即為陽性反應(yīng),每組隨機取8張切片,每張切片隨機取6幅圖,染色結(jié)果采用計算機圖像分析系統(tǒng)處理。

    2 實驗結(jié)果

    2.1 一般情況 造模組大鼠皮毛欠光澤,活動量減少,飲食減少,精神狀態(tài)差,身體消瘦,體重增長較其他幾組緩慢,差異有顯著性意義 (P<0.01)。酒客樂高劑量預(yù)防組大鼠體重與對照組之間差異無顯著性意義 (P>0.05),酒客樂高、低劑量對大鼠體重影響的差異有顯著性意義 (P<0.05),見表1。結(jié)果表明,酒客樂能顯著改善大鼠體質(zhì),且隨劑量增加而作用增強。

    表1 各組大鼠體重變化比較 (±s,g)

    表1 各組大鼠體重變化比較 (±s,g)

    與造模組比較,△△P<0.01;與正常組比較,*P<0.05;與低劑量預(yù)防組比較,□P<0.05

    組別 n 體重4周 8周 12周正常組 8 245±12△△ 309±9△△ 374±8△△造模組 8 194±11 218±10 252±11低劑量預(yù)防組 8 229±9△△* 291±7△△* 336±7△△*高劑量預(yù)防組 8 239±12△△ 304±8△△□ 366±7△△□

    2.2 肝臟病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡觀察:正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝小葉輪廓清晰,肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列,肝細胞分界清,核圓而清晰,位于細胞中央,胞質(zhì)豐富。造模組大鼠肝組織中央靜脈周圍纖維化和肝細胞周圍纖維化,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,匯管區(qū)纖維組織增生,有彌漫性炎性細胞浸潤、肝細胞壞死,可見酒精小體,預(yù)防組和治療組大鼠肝臟中央靜脈纖維化,炎癥、壞死較造模組減輕,肝細胞周圍纖維增生減少,見插頁圖1。

    電鏡觀察:正常大鼠肝臟星狀細胞位于Disse腔內(nèi),胞體小,細胞器不發(fā)達,排列整齊。造模組大鼠肝臟星狀細胞數(shù)量明顯增多,并逐漸向成纖維細胞過渡,表現(xiàn)為細胞槳內(nèi)脂滴減少或消失,富含擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),網(wǎng)腔增大,有的細胞膜下可見致密的細絲束,細胞周圍可見大量纖維束。預(yù)防組和治療組大鼠細胞僅有輕度變性,如線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張及脫粒,細胞壞死少見,見插頁圖2。

    2.3 酒客樂對大鼠血清ALT、AST含量的影響 見表2。

    表2 各組大鼠肝功能比較 (±s,IU/L)

    表2 各組大鼠肝功能比較 (±s,IU/L)

    與造模組比較,△△P<0.01;與正常組比較,*P<0.05;與高劑量預(yù)防組比較,#P<0.05;與低劑量預(yù)防組比較,□P<0.05

    組別n ALT AST正常組 8 50.7±2.9ΔΔ 113.2±12.0ΔΔ造模組 8 281.9 ±24.8 425.1 ±8.6低劑量預(yù)防組 8 179.0 ±15.2ΔΔ* 285.5 ±10.9ΔΔ*高劑量預(yù)防組 8 155.4 ±28.9ΔΔ* 253.5 ±17.0ΔΔ*□治療組 8 198.0 ±15.0ΔΔ*# 315.9 ±19.0ΔΔ*#□

    由表2可知,造模組大鼠ALT、AST值顯著高于正常對照組 (P<0.01)。酒客樂高、低劑量預(yù)防組及治療組大鼠ALT、AST值顯著低于造模組 (P<0.01)。表明酒客樂能降低大鼠血清ALT、AST含量,改善肝功能。

    2.4 酒客樂對大鼠血清PⅢP、LN含量的影響 見表3。

    表3 各組大鼠血清PⅢP、LN含量比較(±s,μg/L)

    表3 各組大鼠血清PⅢP、LN含量比較(±s,μg/L)

    與造模組比較,ΔΔP<0.01

    組別 n PⅢP LN正常組 8 33.41±4.52 ΔΔ 43.4±5.9ΔΔ造模組 8 64.72 ±4.46 70.3 ±8.0低劑量預(yù)防組 8 35.54 ±4.34ΔΔ 45.2 ±7.3ΔΔ高劑量預(yù)防組 8 34.83 ±4.58ΔΔ 44.3 ±7.2ΔΔ治療組 8 35.82±4.37ΔΔ 45.5±7.5ΔΔ

    由表3可知,造模組大鼠血清PⅢP、LN含量顯著高于正常對照組,酒客樂高、低劑量預(yù)防組及治療組大鼠血清PⅢP、LN含量顯著低于造模組,表明酒客樂能顯著降低大鼠血清PⅢP、LN含量,減輕肝纖維化程度。

    2.5 酒客樂對大鼠肝臟表達TGF-β1水平的影響 正常組大鼠肝臟表達的TGF-β1主要分布于門靜脈周圍細胞,導(dǎo)管周圍細胞,肝小葉中央靜脈周圍與肝包膜間質(zhì)細胞。造模組大鼠肝臟表達的TGF-β1在上述部位明顯增加,有的形成網(wǎng)狀間隔。酒客樂高、低劑量預(yù)防組及治療組大鼠肝小葉內(nèi)中央靜脈雖可見TGF-β1染色增強,但比造模組TGF-β1染色程度明顯減輕,且無網(wǎng)狀間隔。免疫組化圖像分析結(jié)果見表4。

    表4 各組大鼠肝臟表達TGF-β1水平的比較

    由表4可知,造模組大鼠肝組織表達TGF-β1水平顯著高于正常對照組。酒客樂高、低劑量預(yù)防組、治療組大鼠肝臟表達TGF-β1水平顯著低于造模組。表明酒客樂能抑制大鼠肝組織TGF-β1產(chǎn)生,抑制細胞外基質(zhì) (ECM)產(chǎn)生,減輕肝纖維化程度。

    3 討論

    中醫(yī)醫(yī)籍中稱酗酒所致疾病為“酒客病”,酒客樂是集歷代中醫(yī)治療酒客病的經(jīng)驗,針對酒精性味辛甘,大熱有毒,氣味俱陽,體濕性熱,易致肝、胃損傷的特點研制而成。方中葛花性味甘涼,芳香輕揚,既能解酒又能醒脾;枳椇子性味甘酸平,《滇南本草》記載:“能解酒毒”。二者均為公認的解酒要藥[5],共為君藥。陳皮理氣健脾,燥濕化痰;紫蘇葉行氣和胃;白豆蔻行氣化濁;檀香理氣和胃,共為臣藥。諸藥相伍,共奏理氣健脾,化濕祛痰,解化酒毒之功效。葛花主要有形成分為異黃酮類,實驗表明葛花的異黃酮類和三萜類成分能使飲用乙醇小鼠血中乙醛含量降低,有利于減輕乙醇中毒。葛花的甲醇提取物尚能抑制肝損害的ALT及AST升高,另外還可降血脂,改善肝臟微循環(huán)[6]。枳椇子為枳椇的干燥成熟種子,含大量葡萄糖、蘋果酸鈣,實驗證明,枳椇子能使小鼠醉酒時間明顯縮短,能降低血中乙醇濃度[7],能顯著增加小鼠綜合體能和抵御不良刺激的能力[8]。

    國內(nèi)外病理學(xué)者研究表明酒精性肝纖維化典型的組織病理學(xué)表現(xiàn)為:①肝星芒狀纖維化 (stellate fibrosis):從門脈區(qū)向肝小葉星芒狀伸展;②肝細胞周圍纖維化 (pericellular fibrosis):各個或數(shù)個肝細胞被包繞的纖維化,不包括沿著肝竇壁伸展的直線性纖維化;③中心靜脈周圍纖維化 (perivenular fibrosis):2/3以上的中心靜脈壁厚度大于4μm;④匯管區(qū)稠密化 (dense fibrosis):門脈區(qū)或纖維隔部位的膠原密集成束狀[9~11]。酒精性肝纖維化形成中,早期以Ⅳ型膠原和LN在竇周沉積為主[12],膠原沉積部位有大量活化的星狀細胞存在[13]。本研究中光鏡和電鏡觀察結(jié)果表明,酒客樂能明顯減輕酒精性肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)改變。

    大量研究表明,血清PⅢP能很好地反映肝纖維組織生成的活動性,它反映的是膠原合成的能力,是觀察抗纖維化藥物療效的較好指標。LN緩慢地參與了肝纖維化的形成過程,其血清值可以反映毛細血管化與匯管區(qū)纖維化。而且,一些常規(guī)的血液學(xué)或肝臟生化學(xué)指標也與肝纖維化進程有不同程度的關(guān)系,如 ALT、AST、γ-GT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶) 等[14]。本研究結(jié)果顯示酒客樂能降低ALT、AST、PⅢP、LN的含量,表明其具有抗酒精性肝纖維化的作用。

    ECM是存在于細胞外的間質(zhì)成分。肝纖維化的病理改變因ECM的增生和降解失衡所致[15,16]。ECM不僅是一種惰性支持物,又具有活躍的生物學(xué)功能,近來研究發(fā)現(xiàn),ECM沉積并非僅僅是一個“空間占有”現(xiàn)象,而是一個動態(tài)過程[17],參與了細胞增殖、分化、遷移等過程,在許多病理過程中ECM發(fā)生改變。TGF-β1是一類多功能的生長因子,參與體內(nèi)多種生理病理過程,對細胞的增殖和發(fā)育、轉(zhuǎn)化的分化都有一定的調(diào)節(jié)作用,對TGF-β1深入研究表明,TGF-β1與肝臟的再生、纖維化及癌變有密切關(guān)系,TGF-β1能促進肝臟ECM生成[18],抑制基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP)的產(chǎn)生及其活性[19],從而抑制ECM的降解,在肝纖維化病理過程中起重要作用。本實驗免疫組化研究表明,酒精性肝纖維化時大鼠肝臟TGF-β1表達增強,酒客樂高、低劑量預(yù)防組和治療組大鼠肝臟表達的TGF-β1較造模組明顯減少(P<0.01),表明酒客樂通過抑制TGF-β1表達而減少ECM的生成,加速ECM降解,最終抑制酒精性肝纖維化的形成。

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