基于權(quán)重配方法的降脂顆粒治療非酒精性脂肪性肝病組分配伍優(yōu)化研究*

葛迎利 宋海燕 張 莉 勵(lì)冬斐 劉 平 季 光，△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院消化內(nèi)科 (上海，200032) 2.上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院 3.上海市浦東醫(yī)院中醫(yī)科

中藥復(fù)方的療效取決于組方中主要藥效組分及其配伍劑量。降脂顆粒是本課題組研發(fā)的中藥復(fù)方，對(duì)非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)有顯著防治作用［1～3］。本研究以降脂顆粒中各藥材的主要有效組分絞股藍(lán)、丹參、干荷葉、虎杖和茵陳提取物為研究對(duì)象［4］，運(yùn)用權(quán)重配方法設(shè)計(jì)［5］構(gòu)建不同比例配伍分組，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)NAFLD藥效學(xué)指標(biāo)，篩選出最優(yōu)有效組分配比，旨在為研制組分明確、質(zhì)量可控、配伍合理、療效肯定的現(xiàn)代中藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠72只，體重 (180±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。絞股藍(lán)、丹參、干荷葉、虎杖和茵陳各藥物的提取物，購(gòu)于西安康威生物工程有限公司;辛伐他汀 (舒降之)，購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司。TG測(cè)定試劑盒、HE染液購(gòu)自南京建成生物制品研究所。

1.2 藥物組分權(quán)重配方設(shè)計(jì) 見(jiàn)表1。

表1 權(quán)重配方設(shè)計(jì)表

應(yīng)用權(quán)重配方法的復(fù)方藥物味數(shù)不超過(guò)6個(gè)，如表1所示，每種藥物都被平均分成6個(gè)劑量，范圍從低劑量至足量。根據(jù)復(fù)方中藥物種類(lèi)數(shù)量從表1中確定選用哪幾列，例如復(fù)方中共有5種藥物，藥物1則對(duì)應(yīng)A列，藥物2對(duì)應(yīng)C列，藥物3對(duì)應(yīng)B列，藥物4對(duì)應(yīng)F列，藥物5對(duì)應(yīng)D列。再根據(jù)選用列名，找到相應(yīng)劑量分配列，確定每種藥物的劑量分配順序，例如，藥物2對(duì)應(yīng)C列，則藥物2在6個(gè)配伍組的劑量分配依次為劑量3、劑量6、劑量2、劑量5、劑量1、劑量4。每種藥物6個(gè)劑量都被均勻地分配到6個(gè)配伍組 (A～F)，這種分布均勻性已被數(shù)學(xué)家證明，根據(jù)藥物量效特點(diǎn)和有效劑量范圍，此表已能滿(mǎn)足藥物配方的實(shí)際需要［5］。

降脂顆粒藥物組成分別為1絞股藍(lán)、2虎杖、3茵陳、4丹參、5荷葉，共5味藥，依據(jù)降脂顆粒原方中藥物劑量及提取物在原藥材中含量比例，并按照人鼠等效劑量換算，同時(shí)設(shè)定每種提取物分3個(gè)劑量水平：低劑量 (劑量1，2)、中劑量為低劑量2倍 (劑量3，4)、高劑量為中劑量2倍 (劑量5，6)，將各組分均勻地分布在配方設(shè)計(jì)表，共獲得6個(gè)配伍組 (A～F)，見(jiàn)表2。

1.3 動(dòng)物造模和分組給藥 雄性Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為正常組、模型組、降脂顆粒6個(gè)配伍組和辛伐他汀組，每組各8只。正常組給予普通飼料，其余給予高脂飼料 (88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司代加工。造模同時(shí)降脂顆粒各配伍組、辛伐他汀組給予相應(yīng)藥物，正常組與模型組給予等體積生理鹽水，灌胃量均為0.1ml·kg-1·d-1，持續(xù)6周。

1.4 藥效檢測(cè)項(xiàng)目及方法 大鼠隔夜禁食，麻醉后腹主動(dòng)脈采血，分離血清，使用7170全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST和HDL、LDL。收集肝組織，4%中性甲醛固定后石蠟包埋，組織切片HE染色。200mg肝組織，剪碎后加入乙醇-丙酮 (1∶1)混合液中 (3ml)，于冰浴中勻漿，取上清液檢測(cè)TG含量。

表2 降脂顆粒組分配伍劑量 (g/100g體重)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組計(jì)量資料以±s表示，各組間差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)比較 見(jiàn)插頁(yè)圖1。圖1顯示，正常組大鼠肝臟細(xì)胞排列整齊;模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂、胞漿疏松化、胞漿內(nèi)有大量脂滴空泡，脂肪變性尤以中央靜脈區(qū)為重;降脂顆粒各組分配伍組與辛伐他汀組均不同程度地改善了肝細(xì)胞脂肪變性，且降脂顆粒各配伍組優(yōu)于辛伐他汀組，E組效果最優(yōu)。

2.2 各組大鼠血清ALT、AST、、HDL、LDL和肝臟TG水平比較 見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST升高;與模型組比較，降脂顆粒組分配伍E、F組有降低ALT水平的趨勢(shì)，其中E組作用較明顯，辛伐他汀組對(duì)ALT水平無(wú)改善;D、E組有降低AST水平的趨勢(shì)，D組較E組優(yōu)，辛伐他汀組無(wú)作用。與正常組比較，模型組大鼠血清HDL顯著降低 (P＜0.05);組分配伍B、D組和辛伐他汀組有升高HDL水平趨勢(shì)。與正常組比較，模型組大鼠血清LDL顯著升高 (P＜0.05);降脂顆粒組分配伍C、E組可顯著降低LDL水平 (P＜0.05)，E組作用最明顯，辛伐他汀組及其他配伍組對(duì)LDL水平無(wú)明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠肝組織TG顯著升高 (P＜0.05);A、B、C、D、E組與辛伐他汀組均可將其顯著下調(diào) (P＜0.05)，其中E組作用最明顯。

表3 各組大鼠血清ALT、AST、HDL、LDL和肝組織TG檢測(cè)結(jié)果(±s)

表3 各組大鼠血清ALT、AST、HDL、LDL和肝組織TG檢測(cè)結(jié)果(±s)

與正常組 (K)比較，◆P＜0.05;與模型組 (M)比較，★P＜0.05

組別 n 血清ALT(U/L) 血清AST(U/L) 血清HDL(mmol/L) 血清LDL(mmol/L) 肝組織TG(mg/g liver)正常組 K 8 49.75 ± 3.77 131.31 ± 11.18 0.53 ± 0.04 0.071 ±0.02 1.00 ± 0.32模型組 M 8 59.26± 4.31 134.11± 10.14 0.40± 0.03◆ 0.104± 0.01◆ 8.84± 1.63◆辛伐他汀組 S 8 61.25 ± 9.56 143.35 ± 16.14 0.41 ± 0.04 0.108 ± 0.02 6.38 ± 1.31★配伍組 A 8 58.22 ± 4.29 126.50 ± 14.10 0.40 ± 0.03 0.104 ± 0.02 6.84 ± 1.10★配伍組 B 8 52.77 ± 3.06 127.53 ± 11.16 0.41 ± 0.03 0.098 ± 0.01 6.50 ± 2.00★配伍組 C 8 54.28 ± 6.87 126.71 ± 13.06 0.40 ± 0.03 0.090 ± 0.01★ 7.10 ± 0.95★配伍組 D 8 52.33 ± 3.81 120.75 ± 12.93 0.41 ± 0.03 0.093 ± 0.01 7.37 ± 1.34★配伍組 E 8 52.01 ± 4.73 123.59 ± 8.74 0.39 ± 0.02 0.088 ± 0.01★ 6.29 ± 0.89★配伍組 F 8 52.26 ± 5.67 126.81 ± 16.59 0.38 ± 0.02 0.109 ±0.02 11.47 ± 2.02

3 討論

中藥復(fù)方具有多種有效物質(zhì)協(xié)同作用、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，其療效的可靠性已經(jīng)為數(shù)千年的中醫(yī)臨床所驗(yàn)證，但由于其成分復(fù)雜，藥材質(zhì)量各異，中藥復(fù)方的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化和處方優(yōu)化相當(dāng)不易。中藥復(fù)方組分配伍模式，是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，利用中醫(yī)藥有效組分并根據(jù)藥理作用進(jìn)行的配伍研究的新模式，是以臨床有效復(fù)方為基礎(chǔ)，將復(fù)方中每味藥當(dāng)成個(gè)體，根據(jù)組方原則和功效病癥，選取每味藥在方中的有效成分或部位，采用現(xiàn)代藥理學(xué)方法進(jìn)行有效成分劑量的最佳配伍研究，從而獲得組分清楚的現(xiàn)代復(fù)方［6］。在一定程度上實(shí)現(xiàn)復(fù)方中有效物質(zhì)質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)化，并有利于藥物作用機(jī)制研究［7］。由本課題組研發(fā)的降脂顆粒，全方由絞股藍(lán)、丹參、干荷葉、虎杖、茵陳五味中藥組成，針對(duì)脂肪肝濕熱痰瘀互結(jié)于肝的病機(jī)，具有清熱利濕化痰、活血祛瘀的功效。結(jié)合前期研究成果和參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們確定了降脂顆粒的主要藥效成分為絞股藍(lán)、丹參、干荷葉、虎杖和茵陳提取物作為研究對(duì)象［4］，擬通過(guò)研究?jī)?yōu)選出對(duì)NAFLD療效最佳的配伍組方。

以數(shù)學(xué)模型探求中藥復(fù)方組方配伍優(yōu)化的研究近年來(lái)逐漸成為熱點(diǎn)。其中權(quán)重配方法［5］是利用優(yōu)化或者超換拉丁方設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)原理，并根據(jù)復(fù)方藥物量效關(guān)系特點(diǎn)，規(guī)范實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立起的新的數(shù)據(jù)分析方法。它為藥物配方實(shí)驗(yàn)提供一種更為科學(xué)、高效和簡(jiǎn)便的手段，適用于中藥復(fù)方多因素、多水平的處方優(yōu)選實(shí)驗(yàn)研究。權(quán)重配方法主要有以下特點(diǎn)：①本法是一種便捷高效的方法，組方優(yōu)選一般僅需6組，就可初步得出結(jié)果。如條件許可，盡量另設(shè)2～3組進(jìn)行確定性試驗(yàn)。②在限定的多藥物多劑量水平范圍內(nèi)，尋找最佳配伍，且結(jié)果符合專(zhuān)業(yè)要求。③能作藥物相互作用的定性分析。④可確定各藥在組方中的重要程度。⑤確定性試驗(yàn)的存在，使得本法的結(jié)果更可靠［8］。鄭青山［9］通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了權(quán)重配方法能有效分析臨床試驗(yàn)中各藥在組方中的地位，并據(jù)此調(diào)整劑量，構(gòu)成新的方案，同時(shí)還可定量設(shè)計(jì)臨床聯(lián)合用藥方案。徐暉等［10］應(yīng)用此方法研究了咪唑安定、芬太尼、異丙酚聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)對(duì)鎮(zhèn)靜催眠作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)咪唑安定、芬太尼、異丙酚在鎮(zhèn)靜催眠上呈相加作用，并確定了三者聯(lián)合用藥的理想誘導(dǎo)劑量。在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用權(quán)重配方法，將5種提取物按照5因素3水平設(shè)計(jì)組方，獲得A～F共6個(gè)降脂顆粒組分配伍組，作為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥效觀察的基礎(chǔ)。

NAFLD的形成主要由于進(jìn)食過(guò)多脂肪或脂肪代謝障礙，導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞內(nèi)積聚，以肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性為主要病理學(xué)改變，從而出現(xiàn)肝臟TG的升高，血清轉(zhuǎn)氨酶等相關(guān)指標(biāo)發(fā)生變化。依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的非酒精性脂肪性肝病診療指南［11］，我們選取血清ALT、AST、HDL、LDL及肝臟TG、肝臟組織病理作為評(píng)價(jià)藥效的主要指標(biāo)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，降脂顆粒組分配伍E組可明顯下調(diào)NAFLD大鼠血清LDL水平，具有降低血清ALT、AST和上調(diào)HDL的趨勢(shì)，顯著減輕脂質(zhì)在肝細(xì)胞的蓄積，顯示較好療效，并優(yōu)于辛伐他汀，可作為治療NAFLD的新藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)和依據(jù)。

本研究應(yīng)用權(quán)重配方法，以6組配伍干預(yù)NAFLD，根據(jù)藥效優(yōu)選的“最佳組分配方”療效確切，表明運(yùn)用權(quán)重配方法篩選降脂顆粒是可靠的，也說(shuō)明權(quán)重配方法在中藥有效組分或成分配伍研究中具有重要研究?jī)r(jià)值，為現(xiàn)代中藥的研制提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

［1］馬贊頌，柳濤，鄭培永，等.降脂顆粒對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟脂質(zhì)的影響 ［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(5)：942-944.

［2］JI G，F(xiàn)AN J，CHEN J，et al.Effectiveness of Danning Tablet in patients with nonalcoholic fatty liver of damp-heat syndrome type：A multicenter randomized controlled trial［J］.JCIM，2008，6(2)：128-133.

［3］馬贊頌，柳濤，鄭培永，等.中藥降脂顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝臟瘦素受體mRNA及P-JAK2/P-STAT3的影響［J］.世界華人消化雜志，2007，15(32)：3360-3366.

［4］LU Y，WANG M，ZHANG L，et al.Simultaneous Determination of Six Components in the “Jiang-Zhi”Granule by UPLC-MS Analysis［J］.Chin J Nat Med，2010，8(6)：449-455.

［5］ZHENG QS，SUN RY.Quantitative analysis of drug compatibility by weighed modification method ［J］.Acta Pharmaco1 Sin，1999，20(11)：1043-1051.

［6］徐峰，蔣蕾，于海，等.治療消化性潰瘍的中藥復(fù)方組分配伍研究 ［J］.中醫(yī)藥信息，2010：27(3)：125-127.

［7］張伯禮，王永炎，商洪才.組分配伍研制現(xiàn)代中藥的理論和方法 ［J］.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2006，20(19)：89.

［8］鄭青山.藥物相互作用動(dòng)力學(xué)理論與實(shí)踐［D］.合肥：中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2001：88-96.

［9］ZHENG QS.Quantitative design of clinical scheme of combination drug therapy ［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，1999，4(4)：325-330.

［10］徐暉，金孝岠，郭錫恩.咪唑安定、芬太尼、異丙酚聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)對(duì)鎮(zhèn)靜催眠作用的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10(10)：1166-1171.

［11］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南［J］.肝臟，2010，3(18)：163-166.