自體間充質(zhì)干細(xì)胞移植異體韌帶重建治療膝交叉韌帶損傷

黃相杰 姜紅江 孟鵬

前交叉韌帶(anterior curiae ligament，ACL)在體育活動中極易損傷，其斷裂后一般不能自發(fā)愈合，目前臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)是韌帶重建術(shù)，但不管用什么移植材料只是起到模板作用，韌帶移植物都要經(jīng)歷缺血壞死炎癥期、再血管化過程、成纖維細(xì)胞增殖和植入期以及韌帶的塑型改造期大致4個相連續(xù)的過程。移植物重塑改造的時間很長，有必要采取措施來加快這一進(jìn)程。我院自2009年10月至2010年10月間運用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)復(fù)合同種異體骨-髕腱-骨移植物重建受損的前交叉韌帶，取得了滿意的臨床療效，現(xiàn)報告如下。

1 臨床資料

本組均為經(jīng)過MRI檢查、臨床理學(xué)檢查及關(guān)節(jié)鏡檢查證實為前交叉韌帶完全斷裂、同時排除了后交叉韌帶損傷及內(nèi)側(cè)副韌帶完全斷裂的患者，且不伴有同側(cè)肢體骨折、骨性關(guān)節(jié)炎等。2009年9月至2010年10月間，共57位患者按照隨機(jī)數(shù)字分別納入實驗組和對照組進(jìn)行手術(shù)治療，出院后繼續(xù)進(jìn)行隨訪。

1.1 實驗組 共31例，其中男18例，女13例;年齡19～52歲，中位年齡32.3歲。體重51～87 kg，平均63.4 kg;身高160～187 cm，平均167.9 cm。受傷因素:運動損傷11例，交通事故15例，高處摔傷5例，傷后到手術(shù)時間為3 d～22個月，中位病程10.8個月。

1.2 對照組 共26例，其中男15例，女11例;年齡18～55歲，中位年齡33.4歲。體重53～86 kg，平均65.1 kg;身高159～188 cm，平均168.7 cm。受傷原因:運動損傷8例，車輛撞傷13例，高處墜落傷5例，傷后到手術(shù)時間為7 d～23個月，中位病程11.2個月。

兩組患者在性別、年齡、身高、體重、致傷原因等一般情況方面均無統(tǒng)計學(xué)意義。所有患者均有患膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)、疼痛、跛行、股四頭肌萎縮致“打軟腿”等癥狀。術(shù)前對患膝關(guān)節(jié)功能分別運用國際膝關(guān)節(jié)文獻(xiàn)委員會(IKDC)評分及Lysholm評分進(jìn)行評估，結(jié)果顯示兩組患膝關(guān)節(jié)功能評分均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(見表1、2)

2 治療方法

2.1 自體間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 實驗組無菌條件下在局麻下于兩側(cè)髂后上棘抽取骨髓60 ml，在200 g的條件下離心骨髓6 min，取上清液，加入等量 PBS，在1000 g的條件下離心6 min，獲取有核細(xì)胞。每平方厘米接種:大約0.8～1.2×106個有核細(xì)胞，在37℃、含20%自體PRP、5%CO2濃度下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每隔3 d換液，細(xì)胞長滿后，消化，凍存細(xì)胞備用。

2.2 移植物準(zhǔn)備 先將同種異體髕骨-髕腱-脛骨(中國人民解放軍骨科研究所組織庫提供)制成骨-髕腱-骨復(fù)合體，近端骨塊修剪成直徑9 mm、長2 cm的骨柱，遠(yuǎn)端骨修剪成直徑10 mm的全長骨柱。再分別在兩端骨柱上間隔5 mm鉆2個直徑1.5 mm的骨孔，用肌腱線編織縫合髕腱并從骨孔引出。將干細(xì)胞懸液與透明質(zhì)酸鈉(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司生產(chǎn))以1:1的濃度混勻備用。將移植物和肌腱線在干細(xì)胞懸液中浸泡30 min;按每點0.1 ml多點均勻注入移植物內(nèi)，再用肌腱線對移植物體部進(jìn)行編織，最后在移植物表面均勻噴涂干細(xì)胞懸液與透明質(zhì)酸鈉混合物，透明質(zhì)酸鈉會逐漸固化附著于移植物表面，然后在工作臺上進(jìn)行預(yù)張，備用。

2.3 手術(shù)方法 采用硬膜外麻醉或全身麻醉，患者仰臥位，患肢下垂，健側(cè)下肢放在支腿架上，患肢大腿根部扎氣囊止血帶。常規(guī)消毒鋪單，前外側(cè)入路進(jìn)鏡，關(guān)節(jié)鏡下常規(guī)探查ACL、后交叉韌帶、半月板和軟骨損傷情況。采用前內(nèi)側(cè)入路，處理合并傷，半月板損傷視情況行全切或次全切成型術(shù)，軟骨損傷者行軟骨成型術(shù)，用籃鉗及刨削器清除原 ACL及滑膜。

首先制備脛骨隧道:將脛骨導(dǎo)向器固定于55°位置上，經(jīng)髕下內(nèi)側(cè)入口置入關(guān)節(jié)腔。將瞄準(zhǔn)點定于原韌帶脛骨殘端中心位置，使脛骨隧道外口中心距關(guān)節(jié)面約3 cm。沿導(dǎo)向器鉆入1根2 mm導(dǎo)針，分別用空心鉆頭和套筒鉆作直徑20 mm隧道，保留所獲松質(zhì)骨供脛骨隧道植骨用。最后修整打磨隧道以適應(yīng)移植物脛骨附著點的解剖外形。后制備股骨隧道:膝關(guān)節(jié)屈曲45°，推開后側(cè)骨皮質(zhì)的骨膜，通過脛骨隧道放入股骨導(dǎo)向器。再繼續(xù)屈膝至60～90°，檢查脛骨隧道后緣是否有碰撞。沿導(dǎo)向器鉆入1根2 mm導(dǎo)針。用空心鉆頭經(jīng)導(dǎo)針在股骨鉆孔，直徑20 mm，深1.5 cm。刮匙和傘形刨削器打磨修整隧道，以適應(yīng)移植物股骨附著解剖外形。保持屈膝60°～90°，從脛骨隧道置入帶槽導(dǎo)針，導(dǎo)針在隧道內(nèi)的位置偏于脛骨隧道前內(nèi)側(cè)，并鉆穿股骨穿出皮膚。將股骨端肌腱線系于帶槽導(dǎo)針尾孔中，牽拉帶槽導(dǎo)針，從大腿側(cè)皮膚拉出，使移植物通過脛骨和股骨隧道。

在關(guān)節(jié)鏡下用大小合適的生物界面可吸收螺釘擠壓骨塊固定;后在關(guān)節(jié)屈曲30°～40°位，后壓脛骨結(jié)節(jié)，拉緊脛骨端骨塊牽引線，再根據(jù)患者骨質(zhì)情況選用1枚與脛骨隧道直徑相同或大1 mm的生物界面螺釘固定脛骨側(cè)骨塊。將剩余干細(xì)胞懸液與透明質(zhì)酸鈉混液在關(guān)節(jié)鏡下注入股骨與脛骨隧道內(nèi)。再次檢查重建ACL的位置、張力和固定穩(wěn)定性以及與髁間窩有無撞擊。最后沖洗關(guān)節(jié)腔，縫合切口。對照組在術(shù)中使用透明質(zhì)酸鈉時不混入干細(xì)胞懸液;其余處理均與實驗組相同，以保證兩組數(shù)據(jù)在邏輯上具有可比性。

2.4 術(shù)后處理 術(shù)后臥床1 d，靜脈注射抗生素3～5 d。麻醉清醒后即進(jìn)行股四頭肌等長收縮，踝關(guān)節(jié)背伸、跖屈及直腿抬高鍛煉。術(shù)后第2天開始患膝CMP鍛煉(0°～90°)1 h，2次/d。術(shù)后2周拆線，可拄雙拐在支具保護(hù)下部分負(fù)重。3～4周內(nèi)膝關(guān)節(jié)活動控制在10°～90°，5～6周時增至0°～110°，7～8周接近正常，開始過伸及下蹲訓(xùn)練。術(shù)后12周去拐僅在支具保護(hù)下行走，強化股四頭肌肌力、關(guān)節(jié)活動度鍛煉。6個月內(nèi)支具保護(hù)并嚴(yán)禁重體力活動。術(shù)后12個月內(nèi)避免患膝劇烈剪切、旋轉(zhuǎn)運動。

2.5 膝關(guān)節(jié)功能評估

2.5.1 理學(xué)查體標(biāo)準(zhǔn) 膝關(guān)節(jié)活動度(ROM)測量方法:做滑板運動的動作，即患者靠近滑板墻仰臥，臀部距離滑板墻約一腳的長度，雙下肢分別放于滑板墻上緩慢向下滑動，直至雙下肢各自都不可以繼續(xù)下滑。此時，用關(guān)節(jié)活動度測量儀分別測量健側(cè)膝和患側(cè)膝的最大下滑角度，計算健側(cè)及患側(cè)關(guān)節(jié)活動范圍之差(見表3)。

表1 兩組患者術(shù)前及術(shù)后各時間點IKDC評分

表2 兩組患者術(shù)前及術(shù)后各時間點LYSHOLM評分

表3 兩組患者術(shù)前及術(shù)后健側(cè)與患側(cè)膝關(guān)節(jié)活動范圍之差(健側(cè)-患側(cè))

2.5.2 患者主觀感覺指標(biāo) 包括IKDC評分及Lysholm膝關(guān)節(jié)評分表(包括跛行、負(fù)重、絞鎖、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲，滿分100分)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料采用了均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗組與對照組內(nèi)部手術(shù)前后的評分運用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗;組間采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05。

3 結(jié)果

兩組患者術(shù)后均恢復(fù)良好，刀口均Ⅰ期愈合，未發(fā)生骨折、感染、關(guān)節(jié)積血、血栓形成等并發(fā)癥，且均未出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。實驗組31位患者中有3例失訪，對照組26位患者中2位失訪，即共52位患者獲得全程隨訪(現(xiàn)仍在隨訪中)，本文截取每位患者12個月的隨訪情況進(jìn)行論述。兩組術(shù)后各個時間點的IKDC及Lysholm評分、關(guān)節(jié)活動度均明顯優(yōu)于術(shù)前評測情況(P＜0.01)。在術(shù)后3個月、術(shù)后6個月及術(shù)后12個月時實驗組與對照組患者的IKDC及Lysholm評分均出現(xiàn)較明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，但是從數(shù)據(jù)上還顯示這種差異在逐漸縮小而非增加。兩組患者健肢與患肢膝關(guān)節(jié)活動度之差在術(shù)后3個月、術(shù)后6個月時顯示出統(tǒng)計學(xué)差異，但這種差異在術(shù)后12個月消失了。

4 討論

目前ACL重建的手術(shù)方法主要有自體或同種異體腱性組織移植以及人工材料等。自體組織移植難以滿足臨床需要，且存在供區(qū)并發(fā)癥。人工韌帶由于沒有較好地解決疲勞斷裂和強度衰減問題，其應(yīng)用受限?，F(xiàn)認(rèn)為，理想的韌帶供體移植條件應(yīng)包括［1］:①容易獲取，有足夠的直徑和長度。②生物學(xué)特性與欲替代的韌帶相似。③獲取后不影響正常的組織結(jié)構(gòu)。④能夠保留和提供新的血供。近年來，由于同種異體深低溫凍存移植物重建膝關(guān)節(jié) ACL有操作簡便、創(chuàng)傷小、可避免自體肌腱移植術(shù)后出現(xiàn)的一系列供區(qū)并發(fā)癥等優(yōu)點，故其在臨床上的應(yīng)用逐漸增多。

盡管自體與同種異體移植物的組織學(xué)與生物力學(xué)特性各有不同，但目前認(rèn)為，無論應(yīng)用哪種移植物其在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的組織學(xué)演化過程相同，都要經(jīng)過移植物的壞死、再血管化、細(xì)胞增殖和膠原纖維重建4個階段，通過爬行替代達(dá)到移植物的“復(fù)活”［2］。無論是自體還是同種異體的移植物，都只是起到支架作用。雖然同種異體肌腱重建ACL可以得到良好的效果，但有幾個先天矛盾的問題是我們無法逾越的:一般為了去除異體移植物的抗原性和防止感染，現(xiàn)在最好的做法就是深低溫凍干法和鈷60γ射線照射法，上述方法難以避免的會對移植物的生物力學(xué)強度產(chǎn)生負(fù)面影響，災(zāi)難性后果就是移植物在術(shù)后發(fā)生斷裂，文獻(xiàn)報道［3］同種異體肌腱移植術(shù)后再斷裂的發(fā)生率為6.5% ～15%，明顯高于自體肌腱移植(0～4.8%)。早期生物力學(xué)強度不足是同種異體肌腱移植再斷裂的重要原因，同時同種異體移植物血管化和塑形速度較自體移植物慢是再斷裂的另一個重要因素。由于自身組織長入需要一段時間，在這段時間內(nèi)移植物必須保持一定的張力，才能保證形成的韌帶有力學(xué)功能。如何使這個替代過程盡可能在較短時間內(nèi)完成是手術(shù)成敗的關(guān)鍵所在。在現(xiàn)階段要求患者延遲負(fù)重與參加體育運動的時間成為臨床醫(yī)師和患者的無奈之舉。因此，促進(jìn)同種異體肌腱移植物盡快“浴火重生”，加速實現(xiàn)膠原纖維的重建，成為該領(lǐng)域的研究熱點。

近年來隨著細(xì)胞工程和組織化學(xué)等技術(shù)的發(fā)展使得細(xì)胞移植成為了可能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有很強的自我復(fù)制和多向分化潛能的干細(xì)胞，研究證實［4］，體內(nèi)外微環(huán)境及各種活性細(xì)胞因子的作用下，同樣可以向多個細(xì)胞系分化，如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱及其他結(jié)締組織。肌腱和韌帶一樣都是特殊形態(tài)發(fā)生變化的成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞在創(chuàng)傷組織修復(fù)過程中起到很大作用。學(xué)者North等證實BMSCs可向韌帶樣成纖維細(xì)胞分化。Watanabe等將轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入野生型小鼠的側(cè)交叉韌帶處，注入的細(xì)胞數(shù)為1×106，28 d后應(yīng)用原位雜交方法發(fā)現(xiàn)，植入的細(xì)胞分化為韌帶成纖維細(xì)胞。

另外，BMSCs移植可以促進(jìn)血管新生在諸多研究中已經(jīng)得到證實，BMSCs移植可以增加缺血臟器的毛細(xì)血管密度，改善缺血器官血流量，目前認(rèn)為其主要機(jī)理可能是 :① BMSCs在局部微環(huán)境誘導(dǎo)下，向內(nèi)皮譜系定向分化，自身形成新生血管，增加缺血區(qū)血管數(shù)量。但是有研究通過用乳酸乙醇酸支架組合成骨樣細(xì)胞與BMSC比較成血管能力時發(fā)現(xiàn)，雖含小鼠支架材料的血管密度較空白對照組明顯增多，但成骨樣細(xì)胞組與BMSCs組分泌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平相差無幾，血管密度基本一致，且成骨樣細(xì)胞是BMSC分化后的細(xì)胞，故認(rèn)為BMSC促進(jìn)血管再生細(xì)胞旁分泌成血管因子是主要作用，與分化的方向相關(guān)性不大。② 被移植的BMSCs通過旁分泌(paracrine)的形式分泌血管生成誘導(dǎo)因子和調(diào)制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)原先存在的血管內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖、遷移、出芽、搭橋，形成新的毛細(xì)血管叢，原有的血竇擴(kuò)張、伸展，血管重塑。其中BMSCs在缺氧環(huán)境和二價金屬離子途徑等誘導(dǎo)下產(chǎn)生的VEGF被認(rèn)為是其促進(jìn)血管再生的主要細(xì)胞因子。

ACL的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與一般的肌腱和韌帶不同，它除了具備致密結(jié)締組織的特性外，還有一個重要的特性就是具有一定的纖維軟骨特性。ACL經(jīng)組織化學(xué)甲苯胺藍(lán)染色呈現(xiàn)異染陽性已被既往學(xué)者所證實，因此其剛性應(yīng)大于一般的韌帶或肌腱組織。它的這種類軟骨特性在緩沖外力方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)應(yīng)用異體移植物進(jìn)行重建時，如果新形成的組織不具備類軟骨的特性，必然會影響膝關(guān)節(jié)的運動功能。因此，可以把完成膠原纖維重建的移植物是否具有類軟骨特性作為組織成熟的標(biāo)志之一。在本研究中將具有多向分化能力的BMSCs移植到移植物表面，除了促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長、加快移植物塑形改造過程外，考慮應(yīng)該還有促進(jìn)移植物體部向具有類軟骨特性方向改造的作用。

另外，本研究采用的是同種異體骨-髕腱-骨作為移植物，所以在愈合過程中并不存在腱-骨愈合的因素。但是我們在手術(shù)過程中同樣對止點進(jìn)行了干細(xì)胞移植。其思路在于，雖然本研究采用了帶骨塊移植物固定的金標(biāo)準(zhǔn)-擠壓螺釘(擠壓理論)，這雖然可以提供堅固的孔內(nèi)擠壓，增加膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性和移植物的等長，避免移植物-骨道的運動，但作為異物骨塊，其實這完全就是用植骨治療骨缺損的翻版。研究人員將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合后植入人為制造的股骨骨缺損中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅12周植入體與骨缺損處即骨性愈合，明顯見新生骨生成，骨缺損能夠完全修復(fù)，而單純植入殼聚糖的對照組骨缺損處僅部分修復(fù)，且部分骨皮質(zhì)不連續(xù)。說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠促進(jìn)骨缺損的盡快骨性愈合。

在本研究中，我們選擇了廉價易得且容易操控固化時間的透明質(zhì)酸鈉作為干細(xì)胞的載體。一般認(rèn)為理想的細(xì)胞載體應(yīng)具備以下特點:①良好的生物相容性及降解性。②骨傳導(dǎo)性及誘導(dǎo)性。③滿意的機(jī)械強度。④可塑形性。⑤可與其他活性分子復(fù)合共同誘導(dǎo)骨發(fā)生。⑥支持細(xì)胞生長和功能分化的表面化學(xué)性質(zhì)與微結(jié)構(gòu)。透明質(zhì)酸鈉作為廣泛存在于人體內(nèi)的生理活性物質(zhì)，是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖組成雙糖單位聚合而成的一種高分子黏多糖。我們用其作為干細(xì)胞的載體，主要是因為本品系生物可降解性高分子聚糖類生物材料制成的高濃度凝膠，無菌、無熱原、無抗原性及致炎性，具有良好的生物相容性及生物學(xué)活性，其所形成的高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有特有的流變學(xué)特性。一般6周左右透明質(zhì)酸鈉即可完全吸收降解，細(xì)胞也已實現(xiàn)了增殖和粘附。另外，我們還出于另外一種考慮而采用透明質(zhì)酸鈉作為BMSCs的載體。經(jīng)體外誘導(dǎo)分化構(gòu)建的軟骨細(xì)胞移植物一旦脫離嚴(yán)格控制的體外培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，能否適應(yīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的理化成分，國內(nèi)外仍無文獻(xiàn)報道。但研究同樣發(fā)現(xiàn)BMSCs在外源性透明質(zhì)酸鈉中生長狀況良好，由于關(guān)節(jié)液中同樣存在透明質(zhì)酸成分，因此我們用透明質(zhì)酸鈉作為緩沖，防止細(xì)胞過早暴露于關(guān)節(jié)液中，但在一定程度上又算是對關(guān)節(jié)液環(huán)境的提前適應(yīng)。

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