RP-HPLC法測定小柴胡湯丸中黃芩苷的含量

肖林林 溫建東 吳堅

小柴胡湯丸(濃縮丸)是由柴胡、法半夏、黃芩等7味中 藥經(jīng)提取分離后制成的中藥復(fù)方制劑。其具有和表解里功效，主要用于寒熱往來，胸脅苦滿，心煩喜吐，口苦咽干，頭暈?zāi)垦５鹊闹委?。原?biāo)準(zhǔn)中沒有含量測定項。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，現(xiàn)采用高效液相色譜(RP-HPLC)法測定方中黃芩的主要成分黃芩苷的含量，方法簡便、測定準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于控制制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(515泵、2487雙波長紫外檢測器);BS-110S電子天平;BP211D電子天平。黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-200212)。小柴胡湯丸(濃縮丸)樣品(市售品)。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-水-磷酸(55∶45∶0.2);流速:1.0 ml/min;檢測波長:280 nm;進樣量:10.0 μl;柱溫:30℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于2500。在此色譜條件下，對照品及供試品溶液在相同的保留時間處有吸收峰，而陰性對照溶液無吸收峰，說明陰性對照對試驗無干擾。色譜見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品適量，加70%乙醇[1]制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備 取本品，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%乙醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率120W，頻率58KHZ)30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取按處方及工藝制備的不含黃芩藥材的樣品，同法制備陰性對照溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系與考察 取黃芩苷對照品約15 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用 70%乙醇分別制成每 1 ml含 15.73 μg、31.46 μg、62.92 μg、125.85 μg、251.70 μg 的對照品溶液，精密吸取上述溶液各10.0 μl，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下，分別進樣5次，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程:Y=3887470.6X－5267.2(r=1.0000)結(jié)果表明，黃芩苷進樣量在0.1573μg～2.517μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取黃芩苷對照品溶液10.0 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件，重復(fù)進樣5次，測定其峰面積值，結(jié)果峰面積的RSD=0.1%(n=5)，表明測定方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液10.0 μl，按上述色譜條件，于配制后第 0、2、4、6、8 h 分別進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為0.8%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，照“2.3”供試液的制備項下方法，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件，分別進樣測定，記錄峰面積，進樣量為10.0 μl。結(jié)果含量的RSD為1.1%(n=6)，表明測定方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品6份，研細，取適量(含量為5.861 mg/g)，精密稱定，分別精密加入定量的黃芩苷對照品溶液(濃度為503.4 μg/ml)。按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件，分別進樣測定，記錄峰面積，進樣量為10.0 μl，計算加樣回收率。結(jié)果方法的加樣回收率為98.0%，RSD=1.1%，表明方法準(zhǔn)確度良好(表1)。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取3批樣品，分別按“2.3”項下方法制備成供試品溶液。按上述色譜條件，分別進樣測定，記錄峰面積，進樣量為10.0 μl，測定樣品含量。結(jié)果3批樣品每1 g含黃芩苷的平均含量分別為5.8 mg、5.2 mg、5.1 mg(n=3)。

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇 實驗比較了用60%乙醇[2]、70%乙醇[2]、80% 乙醇進行超聲處理 30 min[3]的提取方法，結(jié)果以70%乙醇為溶劑超聲處理30 min的方法效果最好，所得供試液雜質(zhì)少，提取率高，因此最后確定以70%乙醇超聲30 min的提取方法。

3.2 流動相的選擇 實驗比較了以甲醇與水的不同比例和是否添加磷酸為流動相進行測定。結(jié)果表明，當(dāng)測定波長為280 nm[3]，流動相為甲醇-水-磷酸(55∶45∶0.2)時，所得到的色譜峰形尖銳、分離度好，故選擇甲醇-水-磷酸(55∶45∶0.2)為流動相。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典.一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:211-212.

[2]賈善學(xué)，王洪星，等.RP-HPLC法測定礞石滾痰丸中黃芩苷的含量.中國藥事，2003，17(3):169-170.

[3]金華，宋新波，等.HPLC法測定雙黃連滴丸中黃芩苷的含量.中草藥，2003，34(5):426-427.