eNOS與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的關(guān)系

王燈亮， 康德智， 張?jiān)。?林章雅， 林元相， 余良宏

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)主要是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血引起，并出現(xiàn)不同程度的腦血管痙攣(cerebral vasospasm CVS)，是引起高致殘率、致死率的主要原因之一。雖然對(duì)SAH后血管痙攣的機(jī)制研究較多，有學(xué)者報(bào)道稱多因子機(jī)制參與了腦血管痙攣的發(fā)生［1］，但目前其具體發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。

NO是一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的催化產(chǎn)物，作為一種氣體，NO不容易直接測(cè)量，因此，常通過(guò)對(duì)NOS的研究來(lái)間接反應(yīng)NO生物學(xué)作用。根據(jù)組織來(lái)源可將NOS分為內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)元型(nNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。近來(lái)有研究顯示eNOS功能紊亂可能參與腦血管痙攣的發(fā)展［2］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兔枕大池二次注血法建立SAH后CVS的模型，運(yùn)用Western blotting觀察在SAH后不同時(shí)間點(diǎn)eNOS表達(dá)的變化，旨在探討eNOS與SAH后腦血管痙攣的關(guān)系，從而進(jìn)一步有助于臨床上的診斷和治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 研究對(duì)象為72只新西蘭大白兔由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供許可證號(hào) SCXK(滬)2007-0007，雌雄不限，體重為2.0～2.8kg，自由進(jìn)食，晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。主要實(shí)驗(yàn)試劑為eNOS多克隆抗體(武漢伊艾博科技有限公司提供)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 成年新西蘭大白兔72只，隨機(jī)分成以下兩組:(1)對(duì)照組(12只)，枕大池注入生理鹽水;(2)SAH組(60只)，按時(shí)間隨機(jī)分為術(shù)后 1d、3d、5d、7d、10d 5 個(gè)亞組，每組 12 只，經(jīng)手術(shù)于枕大池注入兔自體耳中央動(dòng)脈血。

1.2.2 兔SAH模型的制作 采用枕大池二次注血方法建立穩(wěn)定的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。以鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射進(jìn)行麻醉。枕部剃毛，俯臥位固定，消毒后于枕部中線作一直切口，長(zhǎng)2.5cm，鈍性分離直達(dá)寰枕筋膜，2ml注射器針頭經(jīng)皮穿刺枕大池，此時(shí)可見(jiàn)清亮腦脊液流出，按照0.4ml/kg放出腦脊液后，立即從兔耳中央動(dòng)脈抽取等量非抗凝動(dòng)脈血緩慢注入枕大池中。首次注血0.4ml/kg，48h后重復(fù)上述操作，注入動(dòng)脈血0.2ml/kg。二次注血24h后為SAH后第1天，依次類推。對(duì)照組在放完腦脊液后注入等量生理鹽水，余操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 活體灌注 予鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射對(duì)兔進(jìn)行麻醉。打開胸腔，剝開心包膜，將下腔靜脈和腹主動(dòng)脈用動(dòng)脈夾夾閉，剪開右心耳放出血液，再剪開左心室將灌注頭插入主動(dòng)脈然后用動(dòng)脈夾固定。行HE染色檢查的兔子先輸入500ml生理鹽水將血管內(nèi)的血沖洗凈，再注入500ml的多聚甲醛固定液固定。行石蠟包埋后備做檢查。行 Western blotting檢測(cè)的兔子灌入500ml 4℃預(yù)冷生理鹽水，灌注后取出腦組織和基底動(dòng)脈，之后將基底動(dòng)脈分離出來(lái)，置于凍存管中，放入液氮灌中速凍后轉(zhuǎn)入－80℃長(zhǎng)期保存。

1.2.4 標(biāo)本制作及組織學(xué)評(píng)價(jià) 經(jīng)甲醛固定的腦及血管組織石蠟包埋，在每個(gè)基底動(dòng)脈的近、中、遠(yuǎn)段的中點(diǎn)取材，每點(diǎn)連續(xù)取1個(gè)切片，層厚4μm，切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，采用 Leica DM2500顯微鏡以及Image-Pro Plus(Version 5.1)圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)切片中血管標(biāo)本的橫截面積，計(jì)算3張切片平均橫截面積，作為該兔的基底動(dòng)脈管腔面積。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)eNOS表達(dá) 收集對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組基底動(dòng)脈標(biāo)本，使用哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑(RIPA)進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白含量。每個(gè)樣品槽內(nèi)10μl樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移NC膜上，轉(zhuǎn)印后的NC膜用5%脫脂奶粉室溫輕搖30min后加入一抗(濃度1∶500)，室溫輕搖30min后放于4℃過(guò)夜，TBS洗膜后加入濃度為1∶2000的二抗(羊抗兔)，室溫輕搖40min，TBS洗膜，ECL顯色液顯色，拍照。

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察 對(duì)照組腦干腹側(cè)基底動(dòng)脈周圍無(wú)血凝塊，實(shí)驗(yàn)組在1d、3d、5d、7d標(biāo)本基底動(dòng)脈周圍可見(jiàn)明顯的凝血塊，隨時(shí)間的推移，凝血塊的范圍、大小和顏色呈現(xiàn)減退，至第10天，基底動(dòng)脈周圍凝血塊已經(jīng)基本消失(見(jiàn)圖1、圖2)。

2.2 各組基底動(dòng)脈橫截面積比較 基底動(dòng)脈行HE染色后，測(cè)定每個(gè)切片中血管標(biāo)本的橫截面積，取得各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基底動(dòng)脈橫截面積。對(duì)照組基底動(dòng)脈橫截面積為584971.4±80780.1 μm2，SAH 第 1 天為 329441.5 ±15907.5μm2;SAH第3天為 404492.3±73172.1μm2;SAH 第 5 天為300619.6 ±26176.2μm2;SAH 第7 天為242604.7 ±45977.1μm2;SAH 第 10 天為 362157.4 ±38480.7。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組基底動(dòng)脈橫截面積總體小于對(duì)照組，與對(duì)照組比較有差異(P＜0.05)，SAH第3天、第7天和第10天相比，P＜0.05。

2.3 基底動(dòng)脈組織學(xué)變化 在光鏡下，對(duì)照組的血管壁無(wú)增厚，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)彈力膜清晰可見(jiàn)，結(jié)構(gòu)完整。SAH模型組可見(jiàn)血管壁增厚，管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞變性、腫脹，染色質(zhì)不均，空泡形成;內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，平滑肌細(xì)胞排列紊亂。這些改變?cè)赟AH后第1天開始出現(xiàn)，第3天逐漸明顯，第5天和第7天表現(xiàn)最為明顯，第10天上述改變明顯減輕，內(nèi)彈力膜皺縮基本消失，內(nèi)皮細(xì)胞排列漸趨平整，內(nèi)皮細(xì)胞稍有腫脹，管徑基本恢復(fù)正常(見(jiàn)圖3、圖4)。

2.4 各組兔基底動(dòng)脈eNOS表達(dá)情況 Western blotting觀察到eNOS在對(duì)照組大量表達(dá)，對(duì)照組為1.957322 ±0.028485，SAH 第 1 天為 1.833437 ±0.036424;SAH 第 3 天為 1.389229 ±0.072982;SAH第5天為 1.161714±0.030655;SAH 第 7 天為1.239918±0.027786;SAH 第 10 天為 1.434776 ±0.067526。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組第1天表達(dá)開始減少，第5天表達(dá)水平明顯減弱，之后表達(dá)逐漸增加，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖5、圖6)。

圖1 對(duì)照組腦干周圍未見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血

圖2 SAH組第5天腦干周圍大量蛛網(wǎng)膜下腔出血

圖3 對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)彈力膜清晰可見(jiàn)，結(jié)構(gòu)完整

圖4 SAH組注血后第5天內(nèi)皮細(xì)胞變性、腫脹，染色質(zhì)不均空泡形成;內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂

圖5 各組eNOS表達(dá)情況 注:與對(duì)照組比較*P＜0.05

圖6 各組eNOS檢測(cè)結(jié)果

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血后約30%～50%患者會(huì)出現(xiàn)腦血管痙攣，可導(dǎo)致腦缺血、引起神經(jīng)功能障礙、甚至死亡［3］。腦血管痙攣呈雙相性，一種為早發(fā)性，多見(jiàn)于SAH后0.5h～3d，常于4h內(nèi)緩解，也稱急性腦血管痙攣;另一種為遲發(fā)性腦血管痙攣(DCVS)，發(fā)生于出血后4～15d，7～10d為高峰期，2～4w逐漸減少。遲發(fā)性腦血管痙攣不同于急性期腦血管痙攣，其一旦發(fā)生，難于逆轉(zhuǎn)，后果往往較嚴(yán)重［4］。然而，關(guān)于腦血管痙攣的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全闡明。目前普遍認(rèn)為SAH后CVS是由多因素所致，如高分子溶血產(chǎn)物氧合血紅蛋白(OxyHb)的增多、擴(kuò)血管物質(zhì)如NO減少、細(xì)胞凋亡、血液高凝狀態(tài)、免疫炎癥反應(yīng)［5］等因素。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后第1天eNOS表達(dá)開始減少，第5天減少最嚴(yán)重，之后開始慢慢恢復(fù)。HE染色提示SAH后第1天開始出現(xiàn)血管壁增厚，管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞變性、腫脹，染色質(zhì)不均，空泡形成;內(nèi)彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，平滑肌細(xì)胞排列紊亂;第3天逐漸明顯;第5天和第7天表現(xiàn)最為明顯;第10天上述改變明顯減輕。eNOS的表達(dá)與血管壁的病理改變相符。我們認(rèn)為eNOS與腦血管痙攣可能存在一定的關(guān)系，其表達(dá)減少可能參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)展。

eNOS是NO/cGMP信號(hào)途徑的關(guān)鍵酶，通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子和鈣調(diào)蛋白相偶聯(lián)而激活，具有調(diào)節(jié)血管緊張度和保持內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，可能還有神經(jīng)保護(hù)和抗炎癥作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS催化產(chǎn)生NO釋放后，能迅速進(jìn)入鄰近的平滑肌細(xì)胞，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，GC催化產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cGMP)，cGMP激活細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上鈣泵，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣泵入肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣減少，使血管平滑肌處于舒張狀態(tài)［6］。同時(shí)cGMP可通過(guò)抑制蛋白激酶活性，使血管平滑肌舒張。蛛網(wǎng)膜下腔出血后，NO水平下降，則GC活性降低，cGMP生成不足，從而舒張平滑肌能力減弱。eNOS可能通過(guò)解偶聯(lián)作用導(dǎo)致SAH后繼發(fā)腦血管痙攣、微血栓形成，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡［7］。

eNOS合成的NO作為血管調(diào)節(jié)因子的同時(shí)，還具有維持血管壁幾何形態(tài)的作用，對(duì)血管性疾病起到預(yù)防作用。研究表明，在eNOS基因敲除的大鼠模型中，由于eNOS缺乏可以導(dǎo)致血管壁囊性膨出，提示eNOS合成的NO作為血管舒張因子的同時(shí)，還可以起到維持血管壁結(jié)構(gòu)的作用［8］。SAH時(shí)由于血管內(nèi)皮細(xì)胞在毒性作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，使eNOS活性降低，NO的合成減少，NO含量下降，可造成血管痙攣。有學(xué)者指出，eNOS基因多態(tài)性可以預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦血管痙攣的易感性［9，10］。Pyne-Geithman 等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) eNOS 是預(yù)測(cè)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的有用指標(biāo)［11］。許多藥物可能通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)而發(fā)揮減輕腦血管痙攣的作用:雌二醇可能通過(guò)保持eNOS的表達(dá)水平而發(fā)揮減輕腦血管痙攣的作用［12］;川芎嗪毛冬青(毛披樹)可能通過(guò)上調(diào)eNOS的表達(dá)水平增加NO表達(dá)水平從而減輕腦血管痙攣［13］;辛伐他汀通過(guò)上調(diào)eNOS的磷酸化水平而發(fā)揮減輕腦血管痙攣?zhàn)饔茫?4］。

綜上所述，eNOS是合成NO的關(guān)鍵酶，SAH后痙攣的腦血管壁中eNOS減少，從而進(jìn)一步證明了NO減少在血管痙攣的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。繼續(xù)加深對(duì)eNOS的研究可能有利于指導(dǎo)臨床腦血管痙攣的防治。

［1］ Guresir E，Raabe A，Jaiimsin A，et al.Histological evidence of delayed ischemic brain tissue damage in the rat double-hemorrhage model［J］.JNeurol Sci，2010，293(1 ～2):18 － 22.

［2］ Osuka K，Watanabe Y，Usuda N，et al.Modification of endothelial nitric oxide synthase through AMPK after experimental subarachnoid hemorrhage［J］.JNeurotrauma，2009，26(7):1157 －1165.

［3］ Pyne-Geithman GJ，Caudell DN，Cooper M，et al.Dopamine D2-receptor-mediated increase in vascular and endothelial NOS activity ameliorates cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in vitro［J］.Neurocrit Care，2009，10(2):225 － 231.

［4］ 陳新軍，袁先厚，江普查，等.蛛網(wǎng)膜下腔出血血漿一氧化氮、一氧化氮合酶含量及其臨床意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，30(6):497－498.

［5］ 張 健，王 中，周 岱，等.NF-κB、ICAM-1在實(shí)驗(yàn)性SAH后基底動(dòng)脈壁上的表達(dá)變化［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2009，26(6):684－688.

［6］ Murad F.Nitric oxide and cyclic GMP in cell signaling and drug development［J］.N Engl JMed，2006，355(9):2003 －2011.

［7］ Sabri M，Ai J，Knight B，et al.Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase after experimental subarachnoid hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2011，31(1):190 －199.

［8］ Ozum U，Bolat N，Gul E，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene［G894T］polymorphism as a possible risk factor in aneurysmal subarachnoid hemorrhage［J］.Acta Neurochir(Wien)，2008，150(1):57－62.

［9］ Khurana VG，Sohni YR，Mangrum WI，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms predict susceptibility to aneurysmal subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2004，24(3):291 －297.

［10］ Starke RM，Kim GH，Komotar RJ，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene single-nucleotide polymorphism predicts cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage［J］.JCereb Blood Flow Metab，2008，28(6):1204 －1211.

［11］ Pyne-Geithman GJ，Caudell DN，Prakash P，et al.Glutathione peroxidase and subarachnoid hemorrhage:implications for the role of oxidative stress in cerebral vasospasm ［J］.Neurol Res，2009，31:195－199.

［12］ Lin CL，Shih HC，Dumont AS，et al.The effect of 17beta-estradiol in attenuating experimental subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm［J］.Neurosurg，2006，104(2):298 －304.

［13］ Shao Z，Li J，Zhao Z，et al.Effects of tetramethylpyrazine on nitric oxide/cGMP signaling after cerebral vasospasm in rabbits［J］.Brain Res，2010，1361:67 －75.

［14］ Sugawara T，Ayer R，Jadhav V，et al.Simvastatin attenuation of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rats via increased phosphorylation of Akt and endothelial nitric oxide synthase［J］.J Neurosci Res，2008，86(16):3635 －3643.