老年大鼠腦出血后海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化

文玉軍， 王登科， 孫 征， 劉海洋， 張蓮香， 王效軍， 秦 毅

腦出血后，出血灶內(nèi)神經(jīng)元壞死，出血灶周圍神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，患者出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。減少出血灶周圍神經(jīng)元的凋亡、促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的增殖與分化，對(duì)腦出血后患者的神經(jīng)功能恢復(fù)有重要意義。腦出血多發(fā)于老年人，因此，本研究觀察老年大鼠腦出血后海馬齒狀回NSCs的增殖與分化，探討腦出血后NSCs的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備 選用健康老年(18～24月齡，400～550g)SD大鼠［由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(寧)20050001］，分組如下:(1)檢測(cè)細(xì)胞增殖的分組:實(shí)驗(yàn)組選用制備成功的腦出血模型大鼠30只，隨機(jī)分為3d、7d、14d、21d、28d 5 個(gè)亞組，每亞組 6 只;正常組6只;假手術(shù)組6只，術(shù)后7d取材。全部按脈沖法標(biāo)記。(2)檢測(cè)細(xì)胞分化的分組:正常組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組各6只，按累計(jì)法標(biāo)記，術(shù)后28d取材。(3)大鼠腦出血模型制備:參照Rosenberg等［1］的方法加以改良，即選用0.5U/μlⅦ型膠原酶和6.25U/μl肝素的混合液0.22μl立體定位注射到大鼠尾狀核建立腦出血模型。假手術(shù)組注入等量生理鹽水，正常組大鼠不作任何手術(shù)處理。(4)大鼠行為學(xué)評(píng)分:參照Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］對(duì)造模后大鼠進(jìn)行評(píng)分，選取1～4分大鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞 (1)脈沖標(biāo)記:大鼠處死前24h腹腔注射5mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50mg/kg，間隔4h注射一次，連續(xù)注射3次，最后一次注射后24h處死動(dòng)物。此法用于標(biāo)記NSCs的增殖變化。(2)累積標(biāo)記:大鼠腹腔注射5mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50mg/kg，每天一次，連續(xù)注射3d，28d后處死大鼠。此法能標(biāo)記較多的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，用于檢測(cè)增殖細(xì)胞的分化情況。

1.3 細(xì)胞增殖和分化的檢測(cè)

1.3.1 BrdU免疫組化染色 經(jīng)脈沖標(biāo)記的各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)常規(guī)心內(nèi)灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續(xù)冠狀切片，片厚7μm，進(jìn)行免疫組化(SP法)檢測(cè)。切片60℃烘烤過(guò)夜，常規(guī)脫蠟至水，2N HCl(37℃，30min)，3%H2O2(20min)，正常山羊血清封閉(20min，不沖洗)，加入小鼠抗大鼠BrdU抗體(1∶100，4℃過(guò)夜)，生物素標(biāo)記的二抗工作液(37℃，30min)，HRP標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液(37℃，30min)，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染(20s)，脫水，中性樹(shù)膠封片。小鼠抗大鼠BrdU抗體購(gòu)自北京中杉公司，選擇推薦的乳腺癌標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照、PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 BrdU/NeuN 和BrdU/GFAP 雙標(biāo)染色經(jīng)累計(jì)標(biāo)記的各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)常規(guī)灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續(xù)冠狀切片，片厚7μm，進(jìn)行免疫組化雙標(biāo)(SAP/SP法)檢測(cè)。BrdU染色除不滴加3%H2O2外，余步驟同前，用堿性磷酸酶復(fù)合物代替HRP復(fù)合物，滴加NBT/BCIP顯色30min(深藍(lán)色)。然后分別行神經(jīng)元核抗原(NeuN)和膠質(zhì)纖維酸蛋白(GFAP)染色，DAB顯色。小鼠抗大鼠NeuN抗體和兔抗大鼠GFAP抗體均購(gòu)自北京中杉公司，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果觀察及數(shù)據(jù)處理 每只大鼠選3～5張切片，在×400鏡下，每張切片取血腫周圍海馬齒狀回5個(gè)不重復(fù)視野區(qū)，計(jì)數(shù)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和BrdU/NeuN或BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)，利用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用多組間兩兩比較的方差分析q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)變化和腦出血灶病理學(xué)改變

模型組大鼠在術(shù)畢清醒后即可觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀，出現(xiàn)腦出血灶對(duì)側(cè)偏癱癥狀，表現(xiàn)為肢體活動(dòng)遲緩、進(jìn)食減少、多數(shù)大鼠易倒不能臥立，有拖步行走或旋轉(zhuǎn)爬行等神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。術(shù)后6h～24h神經(jīng)功能障礙最為明顯，行為學(xué)評(píng)分值多為4分。腦組織HE染色顯示患側(cè)尾狀核部位神經(jīng)元大量壞死，形成出血壞死灶，周圍腦組織疏松，細(xì)胞腫脹，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管管壁腫脹、破裂。

2.2 老年大鼠海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化 正常組、假手術(shù)組和各出血組老年大鼠的雙側(cè)海馬齒狀回均可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布在顆粒下區(qū)(subgranular zone，SGZ)，細(xì)胞形態(tài)圓而規(guī)則，著色均勻。正常組、假手術(shù)組大鼠BrdU陽(yáng)性細(xì)胞少，散在分布，胞核呈圓形淡染，兩組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。各出血組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，與正常組、假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。出血側(cè)SGZ區(qū)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在術(shù)后3d明顯增多，7d達(dá)到峰值，14d后BrdU陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，28d時(shí)仍高于正常組和假手術(shù)組。出血對(duì)側(cè)SGZ區(qū)也可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞增多，7d時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下降，與正常組、假手術(shù)組相比，各時(shí)段均有顯著性差異(P ＜0.01，P ＜0.05)。出血對(duì)側(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞增加的幅度均較相應(yīng)出血側(cè)低，兩側(cè)比較有顯著性差異(P＜0.01)(見(jiàn)表1、見(jiàn)圖1、圖2)。

2.3 免疫組化雙標(biāo)結(jié)果 和脈沖標(biāo)記相比，累積標(biāo)記的老年大鼠腦內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，在SGZ區(qū)、紋狀體、胼胝體均可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。免疫組化雙標(biāo)結(jié)果顯示，雙標(biāo)細(xì)胞主要見(jiàn)于SGZ周圍，正常老年大鼠腦內(nèi)可見(jiàn)少量散在雙標(biāo)細(xì)胞，腦出血后雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01)。BrdU/NeuN雙標(biāo)細(xì)胞胞核大且深染呈圓形，中央呈深藍(lán)色BrdU陽(yáng)性，周邊呈棕色 NeuN陽(yáng)性(見(jiàn)圖3A)，BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞胞核藍(lán)色淺染呈橢圓形，突起呈棕色且長(zhǎng)短不一(見(jiàn)圖3B)(見(jiàn)表2)。

表1 老年大鼠腦出血后雙側(cè)SGZ區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6±s)

表1 老年大鼠腦出血后雙側(cè)SGZ區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6±s)

與正常組比較有顯著性差異*P＜0.01;與假手術(shù)組比較有顯著性差異△P＜0.01;與假手術(shù)組比較有顯著性差異◇P＜0.05;與出血側(cè)比較有顯著性差異#P＜0.01

組別 出血側(cè) 出血對(duì)側(cè)正常組假手術(shù)組出血3d組出血7d組出血14d組出血21d組出血28d組43.97 ±4.2945.60 ±3.3880.07 ±5.27＊△129.20 ±7.94＊△110.63 ±5.56＊△68.03 ±6.25＊△55.13 ±3.81＊△44.57 ±3.2045.10 ±3.5254.70 ±4.05＊△#97.77 ±5.21＊△#92.00 ±6.11＊△#55.60 ±4.87＊△#47.87 ±4.38＊◇#

表2 老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6)±s)

表2 老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6)±s)

正常組比較有顯著性差異*P＜0.05

BrdU/NeuN BrdU/GFAP正常組出血28d組組別5.77 ±1.1015.77 ±2.05*13.37 ±1.3326.27 ±3.42*

3 討論

在成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，NSCs主要存在于腦室的室管膜下層(SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(SGZ)［3］，NSCs具有星形膠質(zhì)細(xì)胞的特性，從神經(jīng)管至腦發(fā)育晚期一直存在，后形成放射狀膠質(zhì)，是新形成神經(jīng)元的父本并指導(dǎo)新神經(jīng)元的遷移［4］。NSCs在自然增殖過(guò)程中不斷增殖分化，并遷移到特定區(qū)域，以取代老化的神經(jīng)元，從而保護(hù)腦結(jié)構(gòu)和功能的完整性［5］。生理狀態(tài)下，成體腦內(nèi)SVZ和SGZ的NSCs大部分處于靜止期，在運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、環(huán)境改變或腦缺血、缺血再灌注、腦梗死等病理性因素刺激下，其增殖分化可明顯增強(qiáng)［6，7］。腦損傷能不同程度地激活腦內(nèi)NSCs，促進(jìn)其增殖、分化并遷移至受損部位，參與損傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)［8］。

本研究結(jié)果顯示，在正常組、假手術(shù)組和各出血組老年大鼠的雙側(cè)海馬齒狀回均可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布在齒狀回的顆粒層、顆粒下區(qū)。正常組和假手術(shù)組SGZ的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞呈散在分布，腦出血后SGZ的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)成倍增長(zhǎng)，提示腦出血后海馬齒狀回的NSCs可能受到出血等病理因素的刺激，被激活進(jìn)入分裂狀態(tài)引發(fā)細(xì)胞增殖。觀察發(fā)現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞在出血后3d即明顯增多，7d時(shí)增殖顯著，14d時(shí)細(xì)胞增殖減緩，28d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，增殖能力顯著下降，這可能與隨著出血時(shí)間的推移，出血灶不斷機(jī)化、縮小、病理刺激減輕等因素有關(guān)。出血對(duì)側(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較出血側(cè)少，但兩側(cè)細(xì)胞增殖的變化規(guī)律是一致的，提示雖然出血對(duì)側(cè)受到的傷害性刺激相對(duì)較弱，但腦出血后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，腦微環(huán)境的變化可能對(duì)雙側(cè)腦區(qū)NSCs的數(shù)量及其增殖活性均有很大影響，另外也可能與機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等作用有關(guān)［9，10］。Veizovic 等［11］將標(biāo)記的 NSCs 植入成年大鼠缺血對(duì)側(cè)的腦組織，經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)腦組織有移植的NSCs出現(xiàn)，結(jié)合本研究，提示老年后腦內(nèi)可能還保留有早期的細(xì)胞遷移機(jī)制，并可在腦出血等腦損傷后得以活化、啟動(dòng)。

研究表明海馬與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，在SGZ每天可產(chǎn)生大量的新生神經(jīng)元［12］，但隨著年齡的增長(zhǎng)SGZ的NSCs增殖能力會(huì)不斷下降［13］。本研究通過(guò)連續(xù)3d給大鼠腹腔注射BrdU觀察老年大鼠腦出血后SGZ增殖細(xì)胞的分化情況，免疫組化結(jié)果顯示，BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞主要見(jiàn)于SGZ周圍腦區(qū)，腦出血后雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯增加。在腦缺血、腦出血等腦損傷后，腦內(nèi)會(huì)釋放各種刺激因子，如SDF-1因子、凝血酶、促紅細(xì)胞生成素等，同時(shí)與神經(jīng)生長(zhǎng)有關(guān)的生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子等也相繼釋放［14，15］，這些因素可促進(jìn) SGZ干細(xì)胞的增殖與分化，除了分化產(chǎn)生新生神經(jīng)元以補(bǔ)充神經(jīng)元的丟失外，還產(chǎn)生大量的膠質(zhì)細(xì)胞參與病灶的瘢痕修復(fù)。與成年相比，老年后腦內(nèi)微環(huán)境的變化使某些營(yíng)養(yǎng)因子缺乏，有害物質(zhì)積聚，使得NSCs的增殖分化受到抑制，另外，老年后腦內(nèi)毛細(xì)血管明顯減少，其超微結(jié)構(gòu)及血管形狀發(fā)生明顯變化，腦血流量也顯著下降，這些變化不僅可導(dǎo)致原有神經(jīng)元的退行性變，還直接影響新生神經(jīng)元的增殖和存活［16］。

研究表明，腦老化后腦內(nèi)NSCs仍具有一定的增殖活性，并且在某些因素的激發(fā)下其增殖活性可以得以增強(qiáng)。深入了解腦老化機(jī)制及其對(duì)神經(jīng)再生的影響，在腦出血后促使NSCs更多地分化為神經(jīng)元，誘導(dǎo)干細(xì)胞向損傷區(qū)遷移，促進(jìn)新生神經(jīng)元的存活，即通過(guò)調(diào)控內(nèi)源性NSCs以促進(jìn)腦出血后缺損的神經(jīng)功能盡快恢復(fù)，將是今后研究的方向。

圖1 正常老年大鼠海馬齒狀回(A)SGZ區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(B)，SP法，A:×100，B:×400

圖2 老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，SP法，×400。A:3d組;B:7d組;C:21d組;D:28d組

圖3 老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)BrdU/NeuN(A)、BrdU/GFAP(B)雙標(biāo)細(xì)胞，SAP/SP法，×400→標(biāo)示BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，?標(biāo)示NeuN陽(yáng)性細(xì)胞，?標(biāo)示BrdU/NeuN雙標(biāo)細(xì)胞

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