大鼠腦損傷后暴露于冷環(huán)境下血腦屏障通透性變化的研究

習 斌， 萬登峰， 梁愛軍， 沈曉黎， 鄧志峰

近年來，由于極端天氣頻繁出現(xiàn)，長時間暴露在冷環(huán)境下可對機體產生局部的凍傷，特別是四肢凍傷，有學者認為暴露在冷環(huán)境下機體的認知功能下降［1］，而對顱腦損傷后暴露于冷環(huán)境下血腦屏障內皮細胞緊密連接變化的研究報道較少。本實驗采用大鼠顱腦損傷后給予4℃低溫環(huán)境，用干-濕重法測腦含水量和用鑭示蹤劑觀察腦損傷后血管緊密連接開放狀態(tài)，探討大鼠腦損傷后暴露冷于環(huán)境對血腦屏障通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組 健康Sprague-Dawley大鼠(雌雄不限)，體重250～350g，共80只，隨機分為常溫對照組(20只)、冷環(huán)境對照組(20只)、傷后冷環(huán)境組(20只)、傷后常溫組(20只)。每組又按顱腦損傷后取斷頭標本時間不同分為4個亞組:分別為第1天、第3天、第5天、第7天，每個亞組5只。

1.2 冷環(huán)境下腦損傷模型的制備 用10%的水合氯醛(0.35/kg)腹腔內注射麻醉大鼠，麻醉后將其頭部固定于立體定向儀上，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后沿中線右側切開頭皮，分離骨膜顯露右頂骨，用牙科鉆于中線旁2mm、人字縫前2mm鉆孔，形成一直徑約5mm的骨窗，注意保持硬膜完整。采用改進 Feeney，s［2］自由落體打擊大鼠腦組織，定制打擊器導管引導重錘(40g)從25cm處自由落體，撞擊撞針，撞針下陷約2.5mm，致大鼠右頂葉腦損傷。傷后縫合頭皮。傷后常溫組:大鼠腦損傷后立即置于溫度25℃的室溫環(huán)境中正常喂養(yǎng)。傷后冷環(huán)境組:大鼠腦損傷后立即置于溫度為4℃的人工氣候箱，4h后重新放入25℃室溫正常喂養(yǎng)。常溫對照組:僅開顱不致傷，置于25℃室溫正常喂養(yǎng)。冷環(huán)境對照組:僅開顱不致傷，置于溫度為4℃的人工氣候箱，4h后重新放入25℃室溫正常喂養(yǎng)。

1.3 腦組織含水量的測量 各組均于致傷后第1天、第3天、第5天、第7天斷頭取腦，沿挫傷灶中央冠狀面取材(包括對側未損傷腦組織)，厚約2mm，切取腦組織即刻用10%福爾馬林液固定4h。剩下腦組織置于已稱重的帶蓋玻璃稱樣杯中，用電子分析天平稱濕重后置于110℃電熱恒溫干燥箱內干燥至恒重為止，稱量干重，按Elliot公式計算含水量:腦組織含水量=濕重－干重/濕重×100%。

1.4 鑭醛固定液的配置 首先量取0.2mol/L二甲砷酸鈉緩沖液50ml、10%多聚甲醛水溶液20ml、25%戊二醛原液8ml和適量雙蒸水溶解的硝酸鑭(2g)溶液，最后雙蒸水加至100ml，并緩慢加入0.1mol/L NaOH 并把 pH 調至7.4 ～7.8。

1.5 電鏡標本制作 25℃室溫條件下，在各時間段仰臥位固定大鼠，迅速打開胸腔，露出心臟，用灌注針頭從左心插入主動脈弓，剪開右心房，先用等滲生理鹽水沖洗，直至大鼠的血液沖洗干凈，隨后以鑭醛固定液行心臟灌注)固定，15min后開顱，在損傷灶周圍4mm內取2～3塊腦組織，所取腦組織應大小應小于1mm×1mm×lmm，把標本置鑭醛固定液中并放入4℃冰箱8h，用含1%硝酸鑭的二甲砷酸鈉緩沖液洗滌2次，每次15min，立即用含1%硝酸鑭、四氧化鋨酸溶液再浸泡腦組織固定3h，按順序分別用50% 乙醇浸泡15min×1次;用70% 乙醇浸泡15min×1次;用90% 乙醇浸泡15min×1次;用100%乙醇浸泡15min×3次;用純環(huán)氧丙烷浸泡15min×2次;用環(huán)氧丙烷+環(huán)氧樹脂包埋劑1∶1包埋后置于37℃烤箱中1h，再拿出置于純環(huán)氧樹脂中放于37℃ 烤箱中4h。再置入塑料膠囊包埋，放進60℃烤箱中48h，用5型超薄切片機，切60～90nm厚的薄片，置于150個網(wǎng)目的銅網(wǎng)上用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后在日立H-600型透射電鏡觀察并攝片。

1.6 BBB通透性的結果判斷 鑭通透性按等級分類標準:BBB外未見硝酸鑭(+);BBB外有少量硝酸鑭();BBB外有中等量硝酸鑭();BBB外有大量硝酸鑭()。

2 結果

2.1 硝酸鑭示宗法 (1)常溫對照組:在第1天、第3天、第5天、第7天中，La3+都附著在血管腔內壁，血管外沒有鑭顆粒滲出，緊密連接無開放，內皮細胞未見腫脹、壞死，毛細血管腔內膜完整、連續(xù)、光滑、層次清楚(見圖1)。(2)冷環(huán)境對照組:與常溫對照組基本相同。(3)傷后冷環(huán)境組:第1天:血管內可見鑭顆粒，并可見大量鑭顆粒滲出到血管外神經組織及組織間隙中，內皮細胞中也可見鑭顆粒，內皮細胞腫脹，吞飲小泡增多。第3天:可見高密度的鑭顆粒通過增寬的緊密連接間隙，通過基底膜到達細胞外間隙(見圖2)。第5天:鑭顆粒滲透到血管外周圍，與第1天和第3天比較，血管腔內見鑭顆粒滲出明顯減少(見圖3)。第7天:仍有少量鑭顆粒通過基底膜到細胞外間隙，但比第5天明顯少。(4)傷后常溫組:各時間段鑭顆粒滲出情況基本與常溫致傷組相同，都是第1天、第3天滲出達高峰，第5天、第7天持續(xù)逐漸減少，但各時間段滲出的量都比傷后冷環(huán)境組少，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)(見圖4、見圖5)分別為第3天、第5天。(5)大鼠腦損傷后血管緊密連接的變化:鑭顆粒成直線通過血管壁，血管內皮細胞緊密連接呈開放狀態(tài)(見圖6)。

2.2 腦組織含水量變化 傷后常溫組致傷后在第1天時腦組織含水量明顯高于常溫對照組，腦含水量增高持續(xù)至第3天，而第1天、第3天、第5天與同時段的常溫對照組比較均存在明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，傷后第7天仍然高于同時段的常溫對照組，但與同時段的常溫對照組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。傷后冷環(huán)境組在第1天時腦組織含水量明顯高于冷環(huán)境對照組，傷后第5天開始下降，第1天、第3天、第5天與同時段的冷環(huán)境對照組比較均存在明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，第7天仍然高于同時段的冷環(huán)境對照組，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。傷后冷環(huán)境組第1天腦組織含水量高于傷后常溫組，直至增高到第3天，傷后第5天開始下降，第1天、第3天、第5天與同時段的傷后常溫組比較均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，第7天仍然高于同時段的傷后常溫組，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。低溫對照組與常溫對照組各亞組同時段相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(見表1)。

表1 各組不同時間段腦組織含水量(%±s)

表1 各組不同時間段腦組織含水量(%±s)

與冷環(huán)境對照組比較#P＜0.05;常溫對照組比較*P＜0.05;冷環(huán)境對照組比較＆P＜0.05;傷后常溫組比較△P＜0.05

組別 第1天(n=5) 第3天(n=5) 第5天(n=5) 第7天(n=5)常溫對照組冷環(huán)境對照組傷后常溫組傷后冷環(huán)境組77.95 ±0.1577.95 ±0.4481.96 ±0.03*＆82.04 ±0.44#△77.97 ±0.1277.97 ±0.0681.96 ±0.04*＆82.05 ±0.05#△77.98 ±0.0877.97 ±0.0779.77 ±0.39*＆80.55 ±0.35#△77.97 ±0.0977.98 ±0.0678.12 ±0.2078.18 ±0.29

3 討論

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是介于血液和腦組織之間低通透性且具有一定選擇性的動態(tài)界面，半徑大于1nm的親水分子僅少量可被動地通過此屏障，故此屏障是機體的一種保護機制，對穩(wěn)定腦組織內環(huán)境有重要意義。BBB是一個非常復雜的細胞系統(tǒng)，它主要由3層結構組成:(1)內皮細胞(EC)層［各EC以緊密連接(TJ)連接］;(2)血管周圍的星形膠質細胞;(3)以及基膜(BM)等結構構成，而腦組織毛細血管內皮細胞及其細胞間的緊密連接構成的細胞層是BBB的基礎，顱腦損傷后血腦屏障的破壞損傷了血流和腦物質交換的血管內皮細胞層，導致血管中的血漿蛋白和水溶性物質滲透到腦組織中而使腦腫脹、顱內壓增高和血管壓迫性局部缺血等方面促進腦組織進一步損害［3］。

近些年來的研究表明顱腦損傷后BBB通透性的變化與多種機制有關。鄭躍英［4］等認為腦損傷血腦屏障通透性增加可能與水通道蛋4有關;王洪生［5］等認為大鼠腦挫傷后BBB的開放與血管內皮細胞緊密連的中斷有關;Castillo［6］等認為基底膜中Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖黏連蛋白等物質的水解導致血腦屏障的破壞，從而使腦水腫加重。本研究中發(fā)現(xiàn)在對照組中鑭顆粒未滲透到血管壁外，說明其腦組織沒有受到影響，而大鼠顱腦損傷后在各時間點都看到鑭顆粒通過血管進入到神經組織中，并可見內皮細胞緊密連接間距增加，因此本實驗進一步證實腦損傷后血腦屏障通透性增加與血管內皮細胞緊密連接開放有關。

直接暴露于冷環(huán)境下對機體有一定的影響，以往針對冷環(huán)境對機體影響的研究有心血管系統(tǒng)、機體代謝、內分泌系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等。Westfall等［7］將大鼠置于4℃冷環(huán)境7d，發(fā)現(xiàn)慢性冷刺激能夠提高交感神經緊張度，而較長時間處于寒冷環(huán)境中，機體運動神經和感覺神經的功能都會受到抑制。Feng等［8］用冰水刺激大鼠不但引起腦內快速的早期可逆性Tau蛋白磷酸化也導致刺激時間依賴性的遲發(fā)型Tau蛋白磷酸化，說明冷環(huán)境可能是神經變性疾病的一個危險誘導因素。代大偉［9］等認為33℃ ±0.5℃局部腦溫度既通過減輕BBB完整性的破壞在轉錄水平抑制AQP-4 mRNA表達的增加，也可以在翻譯水平直接抑制了AQP-4蛋白質的表達，減輕腦出血后的腦水腫形成。Masahiko［10］等在大鼠腦出血后給予5℃冷環(huán)境，發(fā)現(xiàn)5℃冷環(huán)境能減少腦出血后血腦屏障損害和炎癥反應。有研究報道長時間寒冷暴露對正常神經系統(tǒng)的功能產生影響，因此，闡明在大鼠腦損傷后暴露于4℃冷環(huán)境下BBB通透性變化的機制具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

本研究通過建立大鼠腦損傷后冷環(huán)境下的動物模型，用硝酸鑭示蹤法來驗證血腦屏障通透性。正常情況下鑭顆粒是不能通過BBB的，只有當BBB破壞后鑭顆粒才能通過受損的BBB滲透到血管外。結果發(fā)現(xiàn)，常溫對照組和低溫對照組的血管內皮細胞未見損傷，鑭顆粒沒有滲透到血管外，而傷后常溫組和傷后冷環(huán)境組在第1天、第3天、第5天、第7天中都可見血管內皮細胞層緊密連接開放，鑭顆粒滲透到血管外，且第1天、第3天滲出最多;第5天、第7天逐漸減少，可提示傷后腦通透性改變在常溫與冷環(huán)境的高峰期是在第1天、第3天。傷后冷環(huán)境組滲出的鑭顆粒在各時間點比傷后常溫組多，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，血管內皮緊密連接開放增加，從而促進BBB破壞，進一步加重腦水腫。本次試驗也證實了傷后常溫組腦含水量與傷后冷環(huán)境組比明顯較少，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，因此大鼠腦損傷后暴露于4℃冷環(huán)境下可促進緊密連接的開放，增加血腦屏障通透性，進而加重腦水腫，但暴露于冷環(huán)境下如何促進血腦屏障內皮細胞緊密連接開放的作用機制有待進一步研究。

圖1 常溫對照組和冷環(huán)境對照組:鑭顆粒聚集在血管腔內

圖2 傷后冷環(huán)境組(第3天):大量的鑭滲透到組織間隙中

圖4 傷后常溫組(第3天):血管外神經組織中可見鑭顆粒與(圖2)比，鑭顆粒顯著較少

圖5 傷后常溫組(第5天):血管外周可見少量鑭顆粒與(圖3)比較，鑭顆粒滲出減少

圖6 大鼠腦損傷后血管緊密連接的變化:鑭顆粒以直線通過血少管壁，血管內皮細胞緊密連接呈開放狀態(tài)

［1］ Lieberman HR，Bathalon GP，F(xiàn)alco CM.Severe decrements in cognition function and mood induced by sleep loss，heat，dehydration，and undernutrition during cognition function and mood induced by sleep loss，heat，dehydration，and undernutrition during simulated combat［J］.Biol Psychiatry，2005，57(4):422 －429.

［2］ Feeny DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat［J］.Brain Res，1981，211(1):67 －77.

［3］ Siesjo BK，Siesjo P.Mechanisms of secondary brain injury［J］.Eur J Anaesthesiol，1996，13:247 －268.

［4］ 鄭躍英，蘭允平，祝勝美.大鼠腦缺血/再灌注損傷后梗死灶周圍水通道蛋白4與血腦屏障通透性的動態(tài)變化［J］.中國病理生理雜志，2008，24(8):1647 －1655.

［5］ 王洪生，趙佩林，孫曉峰.大鼠急性局灶性腦挫裂傷后血腦屏障的改變研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2007，17(2):149 －152.

［6］ Castillo J，Leira R，Blanco M.Metalloproteinases and neurovascular injury［J］.Neurologia，2004，19:312 －320.

［7］ Westfall TC，Yang CL，Chen X，et al.A novel mechanism prevents the development of hypertension during chronic cold stress［J］.Auton Autacoid Pharmacol，2005，25(4):171 －177.

［8］ Feng Q，Cheng B，Yang R，el al.Dynamic changes of phosphorylated tau in mouse hippocampus after cold water stress［J］.Neurosci Lett，2005，388(1):13 －16.

［9］ 代大偉，王德生，李克深，等.局部亞低溫對大鼠腦出血后水通道蛋白4表達的影響［J］.中華醫(yī)學雜志，2006，86(13):906－910.

［10］ Kawanishi M，Kawai N，Nakamura T，et al.Effect of Delayed Mild Brain Hypothermia on Edema Formation After Intracerebral Hemorrhage in Rats［J］.JStroke Cerebrovasc Dis，2008，17(4):187 －195.