亞血紅素多肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

趙 玉， 包雪鸚

腦血管疾病是目前嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的主要疾病之一，缺血性腦血管疾病(ischemia cerebrovascular disorders，ICD)占到80%以上，已成為威脅人類(lèi)健康的重大疾病，具有發(fā)病率高、致死率高和致殘率高的特點(diǎn)。在ICD的治療中重建血流或增強(qiáng)缺血區(qū)的血流供應(yīng)是缺血腦組織修復(fù)損傷的必需條件，但同時(shí)帶來(lái)的再灌注損傷也是目前最受關(guān)注的問(wèn)題［1］。本研究通過(guò)建立大鼠腦缺血-再灌注模型，從氧自由基、NO神經(jīng)毒性及神經(jīng)細(xì)胞損傷角度探討亞血紅素多肽對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 亞血紅素多肽，由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供;丹參注射液，批號(hào):0701035，上海中西制藥有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒批號(hào):20080123，丙二醛(MDA)測(cè)試盒批號(hào):20080124，一氧化氮(NO)試劑盒批號(hào):20080123，以上均由南京建成生物工程研究所提供;紅四氮唑(TTC)，批號(hào):20071103，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司提供。

1.2 主要儀器 755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，GF-D200型半自動(dòng)生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體重280～320g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 雄性Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥丹參注射液組(0.36ml/kg)、亞血紅素多肽高劑量組(1mg/kg)、中劑量組(0.3mg/kg)、低劑量組(0.1 mg/kg)。亞血紅素多肽組于缺血前30min舌下靜脈注射不同劑量的藥物(0.1ml/100g)，假手術(shù)組、模型組于缺血前30min舌下靜脈注射等體積的生理鹽水。

2.2 制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)局灶性腦缺血模型參照Z(yǔ)ea longa［2］等報(bào)道的線(xiàn)栓法，加以改進(jìn)。用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定做頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，向上分離頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)，結(jié)扎ECA及CCA的近心端，在CCA遠(yuǎn)心端上剪一小切口，將準(zhǔn)備好的栓線(xiàn)從頸總動(dòng)脈至頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入大腦中動(dòng)脈(MCA)，當(dāng)有輕微阻力時(shí)停止，插入深度約18±0.5mm(自頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處算起)，用縫線(xiàn)結(jié)扎固定魚(yú)線(xiàn)，縫合皮膚，完成了大腦中動(dòng)脈缺血模型的制備。模型成功標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Zea-Longa建立的評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度5級(jí)評(píng)分法標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物清醒后，造模大鼠符合1～3分中任一項(xiàng)或幾項(xiàng)者，視為造模成功，不符合的棄之不用。假手術(shù)組除不插入栓線(xiàn)外其余均同于模型組。于缺血4h后輕輕拔出栓線(xiàn)進(jìn)行腦缺血再灌注。術(shù)中用白熾燈加溫，維持大鼠肛溫約37℃。各組大鼠均在缺血再灌注24h后處死。

2.3 大鼠行為障礙評(píng)分 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Zea-Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。0分:無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常;1分:不能完全伸展左側(cè)前爪;2分:向左側(cè)行走;3分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或追尾狀;4分:不能自主行走、意識(shí)喪失。積分越高，說(shuō)明大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

2.4 腦組織勻漿中SOD、MDA及NO含量測(cè)定 大鼠麻醉后立即快速斷頭、取腦，在冰面上快速取腦組織，分離并去除嗅球、小腦和低位腦干，保留大腦部分，切去大腦海馬區(qū)腦組織0.2g放入預(yù)冷4℃的生理鹽水中，用玻璃勻漿器制成10%的腦組織勻漿液，將此勻漿液3500r/min離心15min，取上清液按試劑盒說(shuō)明操作，進(jìn)行腦組織中SOD、MDA及NO含量測(cè)定。

2.5 大鼠TTC染色及腦梗死面積測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠斷頭取腦，間隔2mm連續(xù)做4個(gè)腦冠狀切片，置于2%磷酸鹽緩沖液中，37℃避光溫浴30min。TTC被線(xiàn)粒體過(guò)氧化氫酶還原，可使正常腦組織染色呈紅色，梗死組織呈白色。用圖像分析軟件測(cè)量梗死區(qū)面積占整個(gè)腦組織面積的百分比，評(píng)價(jià)腦損傷的程度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠行為障礙評(píng)分的影響 大腦中動(dòng)脈栓塞術(shù)后，缺血再灌注模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P＜0.001)，說(shuō)明模型成立。與模型組比較，陽(yáng)性藥組、亞血紅素多肽高劑量組能明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的行為障礙(P＜0.001);亞血紅素多肽中、低劑量組均能不同程度改善缺血再灌注損傷大鼠的行為障礙(P ＜0.01，P ＜0.05)，結(jié)果(見(jiàn)表1)。

3.2 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織SOD、MDA、NO含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性明顯降低，MDA、NO含量明顯升高(P＜0.001)，表明腦缺血再灌注模型成立。與模型組比較，陽(yáng)性藥組、亞血紅素多肽高、中、低劑量組SOD 活性明顯升高(P ＜0.01，P ＜0.05)，MDA、NO 含量明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05);呈劑量依賴(lài)關(guān)系，結(jié)果(見(jiàn)表2)。

3.3 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響 模型組的腦缺血面積明顯高于假手術(shù)組，表明模型復(fù)制成功。與模型組比較，陽(yáng)性藥組、亞血紅素多肽高、中劑量組可明顯縮小腦梗死面積(P ＜0.01，P ＜0.05)，結(jié)果(見(jiàn)表3)。

表1 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠行為障礙評(píng)分的影響χ ± s，n=8)

表1 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠行為障礙評(píng)分的影響χ ± s，n=8)

與假手術(shù)組比較△P＜0.001;與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組模型組丹參注射液組亞血紅素多肽組－ －0.36ml/kg 1mg/kg 0.3mg/kg 0.1mg/kg 0.13 ±0.352.88 ±0.35△1.75 ±0.46△1.88 ±0.35△2.00 ±0.53＊＊2.13 ±0.64*

表2 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿中SOD、MDA、NO含量的影響χ ± s，n=6)

表2 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織勻漿中SOD、MDA、NO含量的影響χ ± s，n=6)

與假手術(shù)組比較△P＜0.001;與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 腦梗死面積(%)

表3 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響 ± s，n=8)

表3 亞血紅素多肽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的影響 ± s，n=8)

與假手術(shù)組比較△P ＜0.001;與模型組比較*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05

組別 劑量 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) NO(umol/L)假手術(shù)組模型組丹參注射液組亞血紅素多肽組－ －0.36ml/kg 1mg/kg 0.3mg/kg 0.1mg/kg 70.81 ±5.2056.76 ±4.06△67.34 ±5.44＊＊66.62 ±4.21＊＊64.51 ±4.25＊＊63.03 ±5.53*8.24 ±1.8817.82 ±2.66△11.85 ±3.50＊＊11.39 ±2.24＊＊11.94 ±3.20＊＊13.52 ±3.48*9.29 ±2.6719.05 ±4.40△10.71 ±3.23＊＊9.52 ±2.95＊＊11.67 ±3.31＊＊12.62 ±3.98*

4 討論

亞血紅素多肽(DhHP-6)是以抗壞血酸過(guò)氧化物酶和微酶的結(jié)構(gòu)為依據(jù)合成的一種含亞血紅素的六肽衍生物，其作為過(guò)氧化物酶模擬物具有過(guò)氧化物酶活性及防止超氧離子和自由基的損害的作用。

在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中產(chǎn)生大量的氧自由基(OFR)，OFR主要通過(guò)系列的過(guò)氧化物反應(yīng)造成組織細(xì)胞的損傷，其中主要的損害為細(xì)胞膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸的過(guò)氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，再經(jīng)過(guò)氧化分解成MDA，最終使磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生變化膜受到嚴(yán)重破壞［3］。SOD是一種廣泛存在的抗氧化酶，它可清除OFR，其值高低直接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是氧自由基攻擊細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物，其值的高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基損傷［4，5］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞血紅素多肽可增高腦組織及血清中SOD活性，降低MDA含量。說(shuō)明該藥可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的清除能力，具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用，且其作用有明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。

LDH是細(xì)胞內(nèi)酶，少量漏出即提示細(xì)胞膜通透性增高，漏出的多少反映細(xì)胞膜的受損程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞血紅素多肽能降低血清中LDH的活性，說(shuō)明亞血紅素多肽可減輕細(xì)胞膜的損傷程度，降低細(xì)胞膜的通透性，具有膜穩(wěn)定性。

由于氧自由基產(chǎn)生，興奮性氨基酸釋放，Ca2+超載等綜合因素導(dǎo)致缺血性腦細(xì)胞損傷，大鼠出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動(dòng)障礙甚至死亡［6，7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示亞血紅素多肽能降低大鼠的行為指標(biāo)評(píng)分，減少梗死面積。說(shuō)明亞血紅素多肽可減輕腦缺血所造成的行為障礙，減少腦細(xì)胞損傷，延長(zhǎng)動(dòng)物的存活時(shí)間。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，亞血紅素多肽具有抗自由基損傷、保護(hù)細(xì)胞膜、減輕酸中毒、減輕腦缺血所造成的行為障礙、延長(zhǎng)動(dòng)物的生存時(shí)間，具有腦保護(hù)的作用。

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