中華苦荬菜治療糖尿病并發(fā)癥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

邸子真，王光函，姜鴻，鄒桂欣

(遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)室，沈陽110034)

中華苦荬菜含有三萜類、倍半萜類、木犀草素及其苷、洋芹苷等黃酮類成分和多種維生素[1-2]。同屬植物抱莖苦荬菜[Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance]被制成注射液用于治療糖尿病并發(fā)癥，取得了良好的療效[3]。齒緣苦荬菜[Ixeris dentate(Thunb)Nakai]在韓國被作為抗糖尿病的民間草藥[4]，但筆者未見中華苦荬菜抗糖尿病的報(bào)道。糖化血紅蛋白(glycolated hemoglobin，HbAlC)和果糖胺分別表示近8～12周和近2～3周的血糖水平，彌補(bǔ)了血糖值時(shí)效性太強(qiáng)的缺點(diǎn)，對于了解平均血糖水平具有實(shí)際意義，其高低與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展呈明顯相關(guān)性[5]。

筆者在本研究中對高脂血癥糖尿病模型大鼠給予不同劑量中華苦荬菜提取物，發(fā)現(xiàn)中華苦荬菜在降低HbAlC和果糖胺方面有顯著的效果，并將藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各提取物指紋圖譜相對峰面積相關(guān)聯(lián)，通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件相關(guān)分析初步確定中華苦荬菜中與抗糖尿病作用相關(guān)物質(zhì)的色譜峰，為進(jìn)一步發(fā)掘中華苦荬菜的藥用價(jià)值奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料

中華苦荬菜藥材采自遼寧省沈陽市，經(jīng)遼寧省藥品檢驗(yàn)所王維寧教授鑒定為菊科植物中華苦荬菜全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備取干燥中華苦荬菜藥材揉碎，分別加10倍量和8倍量水各提取1次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮，放冷，取少量樣品供指紋圖譜分析用，其余用等倍量石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取3次，合并各萃取溶液，減壓回收溶劑至稠膏，少量溶劑溶解，分別加入糊精適量，干燥，研勻，制成樣品每克相當(dāng)于藥材10 g的粉末:1號提取物(石油醚層)、2號提取物(乙酸乙酯層)、3號提取物(正丁醇層)。萃取剩余水溶液減壓干燥至干，稱定質(zhì)量，粉碎成每克相當(dāng)于藥材3.25 g的細(xì)粉，作為4號提取物。以上各提取物分別干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 提取物指紋圖譜分析

2.2.1 儀器與試藥Agilent 1100高效液相色譜分析儀:四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、DAD檢測器、全自動(dòng)進(jìn)樣器(美國Agilent公司)。乙腈(天地公司，色譜純，批號:1004900)，冰醋酸(國藥集團(tuán)，色譜純，批號:200907161217FC)，水(杭州娃哈哈純凈水，批號:T20070911)，其他試劑均為分析純。

2.2.2 色譜條件色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A:0.8%醋酸水溶液，B:0.8%醋酸乙腈溶液，梯度洗脫;流速:1 mL·min-1;DAD檢測器，梯度檢測波長;柱溫:30℃;圖譜記錄105 min。

2.2.3 供試品溶液的制備取“2.1”項(xiàng)下1～4號提取物各1 g，精密稱定，加甲醇50 mL，回流提取2 h，過濾，蒸干，1號定容至1 mL，2，3號分別定容至2 mL，搖勻，取少量溶液高速離心，吸取上清液作為供試品溶液。取4號提取物細(xì)粉1 g，精密稱定，用純化水定容至15 mL，混勻，取少量高速離心，吸取上清液作為供試品溶液。

2.2.4 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)指紋圖譜分析取各供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。取木犀草苷對照品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，并將保留時(shí)間與樣品各指紋峰比較。1～4號提取物共得到36個(gè)共有峰，其中X27與木犀草苷對照品色譜峰保留時(shí)間相同。

2.3 提取物對高脂血癥糖尿病大鼠的作用Wistar大鼠[吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購進(jìn)，合格證號:SCXK(吉)2003-0001]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，稱體質(zhì)量，隨機(jī)取10只喂以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料。其他大鼠喂高脂飼料(在標(biāo)準(zhǔn)飼料中加入10%豬油，10%蛋黃粉和20%蔗糖)，8周后，按30 mg·kg-1劑量一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH4.4)。測48 h后的空腹血糖值和灌胃20%葡萄糖溶液(2 g·kg-1)后30，60，120 min的血糖值，即葡萄糖耐量。選擇空腹血糖≥7.0 mmol·L-1或灌胃葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)服糖后2h血糖≥11.1 mmol·L-1的大鼠作為受試模型。將造模成功的糖尿病大鼠分為7組，分別為模型組、1～4號提取物組、陽性對照組1(二甲雙胍)、陽性對照組2(參芪降糖顆粒)，各給藥組大鼠按相應(yīng)劑量灌胃給予對應(yīng)藥液，給藥容積均為20 mL·kg-1，模型組和空白組灌胃給予等量純化水，連續(xù)給藥4周后，禁食12 h，腹主動(dòng)脈采血測定HbAlC和果糖胺，結(jié)果見表1。

表1 8組大鼠HbAlC與果糖胺測定結(jié)果Tab.1ResultsofHbAlCandfructosamine determination in 8 groups of rats ±s

表1 8組大鼠HbAlC與果糖胺測定結(jié)果Tab.1ResultsofHbAlCandfructosamine determination in 8 groups of rats ±s

與模型組比較，*1P＜0.05Compared with model group，*1P＜0.05

組別大鼠數(shù)HbAlC/%果糖胺/(mmol·L－1)1號提取物組1014.19±2.030.24±0.02 2號提取物組1013.71±1.57*10.23±0.01*1 3號提取物組1013.44±1.18*10.23±0.02*1 4號提取物組912.81±0.87*10.24±0.02陽性對照組11010.77±1.60*10.23±0.03陽性對照組2912.40±1.36*10.25±0.02模型組1015.04±0.990.25±0.02空白組125.58±0.22*10.17±0.01*1

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與結(jié)果使用SPSS13.0版軟件中的雙變量相關(guān)分析可以得到變量兩兩之間的皮爾遜系數(shù)及其統(tǒng)計(jì)量。根據(jù)相關(guān)分析結(jié)果可知，與降低HbAlC呈正相關(guān)的色譜峰有X26(tR=50.47 min)，X28(tR=53.75 min)，X34(tR=60.58 min)，與降低果糖胺呈正相關(guān)的色譜峰有X29(tR=55.14 min)，X30(tR=57.48 min)，X32(tR=58.85min)，X33(tR=59.78 min)。提示以上色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)可能具有降低HbAlC和果糖胺的作用。

3 討論

HbAlC是衡量血糖的金指標(biāo)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)于2010年開展了中國HbAlC教育計(jì)劃，以便使更多的臨床醫(yī)生及患者認(rèn)識到HbAlC的檢測和臨床應(yīng)用的重要性。近年研究表明，控制HbAlC水平可使由糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及清蛋白尿等的風(fēng)險(xiǎn)大幅下降;使并發(fā)高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低[5-7]。果糖胺的濃度與血糖水平呈正相關(guān)，并且相對穩(wěn)定，日間變異小，由于血漿蛋白的半衰期為17～20 d，故可反映檢測前2～3周內(nèi)的平均血糖水平，從一定程度上彌補(bǔ)了HbAlC不能反映較短時(shí)期中血糖濃度變化的不足[8-9]。應(yīng)用果糖胺與HbAlC聯(lián)合測定，有利于更準(zhǔn)確地掌握一段時(shí)間之內(nèi)血糖的變化情況，為評價(jià)藥品穩(wěn)定血糖的能力提供更科學(xué)的依據(jù)。

在樣品指紋圖譜測定中，筆者采用醋酸水-乙腈系統(tǒng)，隨著乙腈比例的增加基線逐漸升高，后在乙腈中也加入了同樣比例的醋酸，使酸度保持恒定，解決了基線漂移的問題。Agilent 1100配置的DAD檢測器可以同時(shí)進(jìn)行5個(gè)波長的掃描，通過多個(gè)波長的比對發(fā)現(xiàn)0～20 min在252 nm波長下色譜峰的信息量大且各色譜峰有較高的響應(yīng)值，20 min之后324 nm下各主要色譜峰的響應(yīng)值大，基線干擾小，所以設(shè)置了梯度檢測波長。

在該色譜條件下，對樣品同時(shí)進(jìn)行了在線紫外掃描，獲得了每個(gè)色譜峰對應(yīng)物質(zhì)的紫外掃描圖譜(波長190～400 nm)。發(fā)現(xiàn)X26，X28，X29，X30，X32，X33，X34色譜峰均在230～232 nm和316～329 nm兩處有較強(qiáng)的吸收峰。提示他們有可能為具有相同或相似官能團(tuán)的物質(zhì)。將3號提取物回流提取之后調(diào)成酸性，用乙酸乙酯萃取，再通過D101大孔吸附樹脂柱分離，可于40%乙醇洗脫液中得到較純的該物質(zhì)群，提示其為中等極性，與木犀草苷極性相似的物質(zhì)。

同屬植物抱莖苦荬菜的注射液已經(jīng)在治療糖尿病并發(fā)癥發(fā)面取得了良好的療效，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示中華苦荬菜也有可能成為一種防止或延緩糖尿病并發(fā)癥的良藥，而且抱莖苦荬菜中治療糖尿病并發(fā)癥的有效成分可能就是中華苦荬菜降低HbAlC和果糖胺的同類成分，還有待對兩種中藥的對比研究進(jìn)一步證實(shí)。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(第二十一卷)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:879－880.

[2]王曉飛，王曉靜.中華苦荬菜研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2006，25(4):238－239.

[3]穆長吉，孫曉坤，王豫桐，等.苦碟子注射液在2型糖尿病慢性并發(fā)癥中的應(yīng)用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(3):330－331.

[4]SHWU-WOAN L.A new sesquiterpene lactone glycoside ofIxeris chinensis[J].Heterocycles，1994，38(8):1933－1936.

[5]張冬青，汪德清.糖化血紅蛋白與糖尿病并發(fā)癥的相關(guān)性研究[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(4):467－468.

[6]覃彥平.糖化血紅蛋白檢測及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，9(1):48－50.

[7]蔣亞斌，聶立紅.2型糖尿病糖化血紅蛋白控制率及其與并發(fā)癥的關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(12):2180－2182.

[8]王海濱，王炳輝.糖化血紅蛋白、果糖胺在臨床檢測中的重要性[J].中國醫(yī)藥指南，2008，6(17):298－301.

[9]陳新立，呂德純.血清果糖胺測定在糖尿病診治中的意義[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15(31):46.