通絡(luò)中藥結(jié)合外周血干細(xì)胞移植治療糖尿病足的療效觀察及其對氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響*

高懷林，丁來標(biāo)，曹月香，李會玉，張 華，孔 青，尹曉華

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院，河北省中醫(yī)藥絡(luò)病理論指導(dǎo)糖尿病足防治重點(diǎn)研究室，石家莊 050091)

通絡(luò)中藥結(jié)合外周血干細(xì)胞移植治療糖尿病足的療效觀察及其對氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響*

高懷林，丁來標(biāo)，曹月香，李會玉，張 華，孔 青，尹曉華

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院，河北省中醫(yī)藥絡(luò)病理論指導(dǎo)糖尿病足防治重點(diǎn)研究室，石家莊 050091)

目的:觀察通心絡(luò)(TXL)提高自體外周血干細(xì)胞移植(peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT)治療糖尿病足(diabetic foot，DF)的臨床療效及探討其作用機(jī)制。方法:將60例糖尿病足患者隨機(jī)分為通絡(luò)組(通心絡(luò)結(jié)合自體外周血干細(xì)胞移植)和干細(xì)胞組(干細(xì)胞移植)。觀察移植12周后臨床癥狀和踝肱壓指數(shù)(ankle brachial index，ABI)及經(jīng)皮氧分壓(transcutaneous oxygen partial pressure，TcPO2)變化并進(jìn)行評估，觀察丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAOC)。結(jié)果:通絡(luò)組和干細(xì)胞組患者的疼痛、冷感、麻木和間歇性跛行等癥狀明顯緩解(P＜0.01)及通絡(luò)組可提高患者 ABI和 TcPO2(P＜0.01或P＜0.05)，降低 MDA(P＜0.01)和升高 TAOC(P＜0.01)，干細(xì)胞組可升高TcPO2(P＜0.01)。通絡(luò)組與干細(xì)胞組臨床癥狀評分、ABI、TcPO2、MDA和TAOC比較差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)，通心絡(luò)組優(yōu)于干細(xì)胞組。結(jié)論:通心絡(luò)對干細(xì)胞移植具有促進(jìn)作用，可提高臨床療效，可能與其抗氧化作用有關(guān)，故通心絡(luò)結(jié)合自體PBSCT是一種安全、有效的治療糖尿病足的新方法。

通心絡(luò);干細(xì)胞移植;糖尿病足;氧化應(yīng)激

糖尿病足是糖尿病常見的致殘致死性并發(fā)癥，其主要特點(diǎn)為下肢血管遠(yuǎn)端流出道閉塞且越遠(yuǎn)端病變越重，故藥物治療、血管搭橋、介入手術(shù)等療效欠佳［1、2］。近年來，隨著干細(xì)胞移植治療缺血性疾病研究的不斷發(fā)展及促血管新生的中醫(yī)藥研究日益深入，使采用干細(xì)胞結(jié)合中藥等治療性血管生成方法在缺血部位重建有效的側(cè)支循環(huán)成為可能且優(yōu)于單純干細(xì)胞治療效果。本研究旨在探索通絡(luò)中藥結(jié)合自體外周血干細(xì)胞移植治療糖尿病足的有效途徑。

1 資料與方法

1.1 研究對象

觀察病例來自我科2009年1月～2011年6月住院的2型糖尿病足患者，根據(jù)研究設(shè)計隨機(jī)分為通絡(luò)組(通心絡(luò)+自體外周血干細(xì)胞移植)、干細(xì)胞組(自體外周血干細(xì)胞移植)。通絡(luò)組30例，男19例，女11例，平均年齡55.5歲±14.6歲;干細(xì)胞組30例，男17例，女 13例，平均年齡 54.8歲 ±11.4歲，共觀察60例。2組患者性別、年齡、癥狀評分、ABI、TcPO2等基線資料均無明顯差異(P＞0.05)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 病例選取條件根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)對糖尿病足病的定義選擇患者，且①所有患者肢體至少存在以下病變中的兩種或以上:肢體疼痛、患肢冷感、間歇性跛行、皮膚顏色蒼白或紅紫、潰瘍、皮膚溫度改變、踝肱壓指數(shù)降低;②所有入選患者經(jīng)彩色多普勒檢查均有腘動脈以下流出道狹窄或閉塞;③控制患者空腹血糖 ＜7.0mmol/L，非空腹血糖＜10.0mmol/L;④入選患者在進(jìn)行治療前均填寫知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①血糖控制不理想的糖尿病病人(糖化血紅蛋白＞7.0%和增殖性視網(wǎng)膜病變);②惡性腫瘤患者及合并有心血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾患;或一般情況差不能耐受干細(xì)胞移植手術(shù)者;③精神病患者;④妊娠、哺乳期婦女或?qū)Ρ狙芯克幬镞^敏者。

1.2 方法

1.2.1 自體外周血干細(xì)胞采集 自體外周血干細(xì)胞動員(吉粒芬 450～600u皮下注射，連用5天)，第5天白細(xì)胞總數(shù)達(dá)20.2～60.4×109/L，第6天采集外周血干細(xì)胞，用 COBE6.1pectraversion細(xì)胞分離機(jī)單獨(dú)采集的干細(xì)胞，根據(jù)患者CD34陽性細(xì)胞，外周血白細(xì)胞總數(shù)，患者下肢缺血的程度總采集量在80～140ml。將采集的單核細(xì)胞配制成1～6×108/ml的細(xì)胞混懸液。為防止高白細(xì)胞血癥導(dǎo)致心、腦血管事件或血栓栓塞，在行外周血干細(xì)胞動員的同時給予低分子肝素鈣 5000 IU/d，每日2次，皮下注射;每日監(jiān)測外周血白細(xì)胞計數(shù)、出血和凝血及臨床癥狀變化。

1.2.2 治療方法 通絡(luò)組(通心絡(luò)膠囊+自體外周血干細(xì)胞移植):通心絡(luò)，每次4粒，1 d 3次，移植前1周開始口服(通心絡(luò)膠囊 國藥準(zhǔn)字Z199980015，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))。干細(xì)胞組:自體外周血干細(xì)胞移植。

1.2.3 其他治療 如果患者存在足部感染，移植前應(yīng)用抗生素控制感染后進(jìn)行移植;在干細(xì)胞移植的同時兩組均給予前列地爾、西洛他唑、丹參注射液等常規(guī)藥物治療。強(qiáng)化控制血糖、血脂、血壓、心臟功能等各項指標(biāo)達(dá)標(biāo)。術(shù)后積極進(jìn)行抗感染及對癥支持治療，足部潰瘍定期局部換藥及清創(chuàng)治療。

1.2.4 干細(xì)胞移植術(shù) 嚴(yán)格無菌操作，2%利多卡因20ml局部注射阻斷腓腸神經(jīng)，用1ml注射器攝取干細(xì)胞混懸液，循大血管的走行2.5cm～3.0cm×2.5cm～3.0cm間距進(jìn)行肌肉注射，潰瘍周圍重點(diǎn)注射，每個點(diǎn)注射 0.8ml～1.0ml，注射深度為2.5cm～3.0cm，注射完畢用無菌治療巾包裹。根據(jù)病情移植1～2次。操作完畢，移植部位消毒。囑患者臥床休息。移植后處理:移植后用青霉素預(yù)防感染3d～5d。

1.2.5 觀察指標(biāo) 表1顯示，在干細(xì)胞移植前、干細(xì)胞移植后12周時分別檢查以下指標(biāo):①癥狀評分量表［3］;②踝肱壓指數(shù)(ABI)(瑞典 Perimed公司，PeriFlux 5000激光多普勒及經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測儀);③經(jīng)皮氧分壓(瑞典 Perimed公司，PeriFlux 5000激光多普勒及經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測儀);④丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAOC)測定:均應(yīng)用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行;⑤不良反應(yīng)觀察:觀察有無異常癥狀、體征出現(xiàn);觀察血、尿、糞常規(guī)及心電圖、肝、腎功能、凝血4項的改變。

表1 糖尿病足患者癥狀評分量表

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計描述。計量資料采用配對t檢驗和 t檢驗，以 P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者治療前后癥狀評分變化 2組患者治療后與治療前比較，患者的疼痛、冷感、麻木、間歇性跛行差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);2組間比較，疼痛、冷感、麻木、間歇性跛行差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或 P＜0.05)。

2.2 2組患者治療前后ABI、TcPO2評分變化

表3顯示，2組患者治療后與治療前比較，通絡(luò)組ABI、TcPO2差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或 P＜0.05)，干細(xì)胞組 ABI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，TcPO2差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);2組間比較，ABI、TcPO2有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表22 組患者癥狀變化(n=30，±s)

表22 組患者癥狀變化(n=30，±s)

注:與組內(nèi)治療前比較:*P＜0.01;治療后通絡(luò)組與干細(xì)胞組比較:△P＜0.01，☆P＜0.05

組 別 疼痛 冷感 麻木 間歇性跛行通 絡(luò) 組 治療前3.05±0.96 3.13±1.21 1.93±1.12 3.25±1.15治療后 0.72±0.33＊△ 0.64±0.26＊△ 0.86±0.35＊☆ 2.62±0.33＊☆干細(xì)胞組 治療前 2.99±1.15 2.76±0.81 2.01±1.03 2.01±1.03治療后 1.37±0.82* 1.15±0.71* 1.16±0.54* 1.15±0.56*

表32 組患者ABI、TcPO2指標(biāo)變化(n=30，±s)

表32 組患者ABI、TcPO2指標(biāo)變化(n=30，±s)

注:與組內(nèi)治療前比較:*P＜0.01，#P＜0.05;治療后通絡(luò)組與干細(xì)胞組比較:☆P＜0.05

組 別 ABI TcPO2通 絡(luò) 組 治療前0.39±0.16 33.42± 7.23治療后 0.62±0.18#☆ 41.34± 9.21＊☆干細(xì)胞組 治療前 0.38±0.23 32.12±11.35治療后 0.53±0.04 36.56±11.62*

2.3 2組患者治療前后MDA、TAOC評分變化

表4顯示，2組患者治療后與治療前比較，通絡(luò)組MDA、TAOC差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)，干細(xì)胞組 MDA、TAOC差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);2組治療后比較，MDA、TAOC均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表42 組患者M(jìn)DA、TAOC指標(biāo)變化(n=30，±s)

表42 組患者M(jìn)DA、TAOC指標(biāo)變化(n=30，±s)

注:與組內(nèi)治療前比較:*P＜0.01，#P＜0.05;治療后通絡(luò)組與干細(xì)胞組比較:△P＜0.01。

組 別 MDA(nmol/ml) TAOC(U/ml)通 絡(luò) 組 治療前8.24±3.95 8.52±4.21治療后 6.17±2.66＊△ 10.70±4.26＊△干細(xì)胞組 治療前 8.09±4.25 8.32±4.33治療后8.11±3.52 8.45±4.31

2.4 不良反應(yīng)

術(shù)后第2天5例患肢出現(xiàn)劇烈疼痛，均于7d內(nèi)自行緩解，無需其他治療;3例術(shù)后第2～3天出現(xiàn)低熱，未超過38.5℃，3d內(nèi)降至正常范圍;所有患者手術(shù)前后心電圖、肝腎功能無特殊改變，出凝血時間正常，注射部位均無紅腫、疼痛、滲出、潰瘍情況等不良反應(yīng)。

3 討論

糖尿病足早期多為皮膚改變，包括足部皮膚色澤異常、皮膚溫度減低、皮膚水皰、丘疹、淺表破潰等，如不及時診治則可以迅速發(fā)展為潰瘍、截肢，由于糖尿病足發(fā)現(xiàn)比較晚，常常合并廣泛的感染，所以足潰瘍和截肢很常見［4］。糖尿病足是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴(yán)重影響了患者的身心健康。自體外周血干細(xì)胞移植是近年來新興的一項治療技術(shù)，大量的實驗和臨床應(yīng)用證明自體PBSCT是治療下肢缺血性疾病的一種很有應(yīng)用前景的方法。由于人體干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成新生血管，故將自體外周血里的干細(xì)胞移植到缺血的下肢內(nèi)，使其逐漸分化并形成新的毛細(xì)血管，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，改善和恢復(fù)下肢血流，達(dá)到治療下肢血管病變與糖尿病足的目的［5～8］。但有時新生血管及側(cè)支循環(huán)建立較慢且數(shù)目較少，使臨床療效不甚理想。近年來，中藥在促血管新生方面研究不斷深入，王文?。?］等發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)大劑量可促進(jìn)雞CAM的血管增生，具有一定的促血管新生作用;通心絡(luò)［10］能夠通過促進(jìn)VEGF大量表達(dá)而保護(hù)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促毛細(xì)血管新生。以往報道［11］糖尿病足患者其氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)，抗氧化狀態(tài)減弱，通心絡(luò)［12～14］對急性心肌梗死、腦血管病有很好的抗氧化作用。那么通心絡(luò)結(jié)合干細(xì)胞移植是否會增加臨床療效，并會通過抗氧化改善內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)建立，改善下肢缺血狀態(tài)。

本實驗通過對2組患者組間進(jìn)行比較，通絡(luò)組在改善冷感、麻木感、疼痛、間歇性跛行方面優(yōu)于干細(xì)胞組，說明在干細(xì)胞移植時應(yīng)用通絡(luò)中藥可以明顯改善患者癥狀，并優(yōu)于干細(xì)胞組。但由于我們觀察期較短，中藥促血管新生的作用尚未完全體現(xiàn)，一些臨床癥狀尚需長期觀察以客觀評價通絡(luò)中藥的療效。在干細(xì)胞治療早期，干細(xì)胞組治療后ABI無明顯改善，但干細(xì)胞加通心絡(luò)后ABI有明顯變化。究其原因，ABI指標(biāo)主要反映主干血管的供血情況，干細(xì)胞在體內(nèi)肌肉內(nèi)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，然后演變?yōu)楹芏嗟男〉拿?xì)血管，主要變?yōu)樾〉膫?cè)支血管，只有小腿上側(cè)支血管的血流達(dá)到足背動脈和脛后動脈后才能使ABI增加［15］;另外，干細(xì)胞移植的時間短，血管重建需要一定的時間，新生血管及側(cè)支循環(huán)尚未完全建立，所以干細(xì)胞移植短期內(nèi)對ABI指標(biāo)影響較小，但加入通絡(luò)中藥后 ABI改善明顯，說明通絡(luò)中藥有一定的加速促進(jìn)血管新生作用。經(jīng)皮氧分壓以反映局部血供情況為主，中藥的優(yōu)勢在于促進(jìn)血管新生、改善微循環(huán)，在干細(xì)胞移植治療早期即可發(fā)揮作用，這表現(xiàn)為通絡(luò)組 TcPO2的改善度優(yōu)于干細(xì)胞組，可以認(rèn)為通絡(luò)組對局部微循環(huán)的改善程度優(yōu)于干細(xì)胞組。從 2組間臨床癥狀、客觀指標(biāo)(ABI、TcPO2)比較結(jié)果來看，通絡(luò)組均優(yōu)于干細(xì)胞組?？梢宰C實通絡(luò)中藥可以加強(qiáng)干細(xì)胞移植的治療效果。另外，實驗證明通絡(luò)組與干細(xì)胞組比較，MDA下降，TAOC升高，通絡(luò)組有抗氧化的作用。以上實驗提示通心絡(luò)具有增強(qiáng)自體外周血干細(xì)胞移植治療糖尿病足療效的作用，可能與通心絡(luò)具有抗氧化，改善患者內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞移植后血管新生，建立側(cè)枝循環(huán)的作用有關(guān)，其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。且本課題未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，是一種安全、有效的中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病足的新方法。

［1］Rmstrong DG，ykberg RG．a(chǎn)ssifying diabetic foot surgery:toward a rational definition［J］．Diabet Med，2003，20(4):329-331．

［2］王富軍，杜亞萍，楊艷輝，等．自體外周血干細(xì)胞移植治療糖尿病足11 例臨床研究［J］．臨床薈萃，2007，22(23):1729-1730．

［3］高繼平，書 桂，黃平平，等．脈炎消治療多發(fā)性大動脈炎39例臨床分析［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，1996，2(3):145．

［4］許樟榮．糖尿病足病的防治［J］．中國實用內(nèi)科雜志，2007，27(7):485-487．

［5］秦漢林，高 斌．自體干細(xì)胞移植治療糖尿病足的研究進(jìn)展［J］．介入放射學(xué)雜志，2010，19(9):753-758．

［6］Tepper OM，Capla JM，Capla JM．Human endothelial progenitor cells fromtype Ⅱ diabetics exhibit impaired proliferation，adhesion，and incorpora-tion into vascularstructures［J］．Circulation，2002，106(22):2781-2786．

［7］Iwaguro H，Kalka C，Kalka C．Endothelial progenitor cell vascular growth factorgene transferforvascularregeneration［J］．Circulation，2002，105(2):732-738．

［8］Schatteman GC，Jiao C，Jiao C．Blood-drived angioblasts accelerate blood-flow restoration in diabetic mice［J］．Journal of Clinical Investigation，2000，106(11):571-578．

［9］王文鍵，傅曉東，陳偉華，等．通心絡(luò)促血管生成作用的實驗研究［J］．疑難病雜志，2003，2(1):2．

［10］馬 芳．通心絡(luò)促腦缺血后毛細(xì)血管新生的實驗研究［J］．衛(wèi)生職業(yè)教育，2004，22(17):151-152．

［11］高利娟．血清丙二醛、總抗氧化能力、維生素E與糖尿病下肢血管病變的關(guān)系［J］．中國誤診學(xué)雜志，2010，10(4):774-775．

［12］段 煉，楊 剃，張海濤，等．豬急性心肌梗死再灌注后氧化應(yīng)激損傷及通心絡(luò)的保護(hù)作用［J］．中國病理生理雜志，2010，26(3):430-434．

［13］袁凌燕，張紅旗，徐丹令，等．通心絡(luò)超微粉對“絡(luò)氣虛滯”大鼠血管氧化損傷的保護(hù)作用［J］．中醫(yī)雜志，2009，50(7):642-645．

［14］謝蓮娜，曾定尹，張海山，等．通心絡(luò)通過降低循環(huán)血管緊張素Ⅱ水平及抑制局部氧化應(yīng)激反應(yīng)預(yù)防血管痙攣［J］．中國動脈硬化雜志，2010，18(9):677-681．

［15］谷涌泉，張 健，許樟榮，等．糖尿病足病診療新進(jìn)展［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:348-349．

R285．6

B

1006-3250(2011)12-1350-02

河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(2009166)

2011-07-02

高懷林(1965-)，男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事糖尿病與絡(luò)病的理論與臨床研究，Tel:13833114748，E-mail:gaohuailin@126.com。