姜黃素對慢性應激模型大鼠學習記憶能力的影響

朱潔瑾，廖守法，趙樂萍，都霞，林蒙蒙，潘建春

（1.溫州醫(yī)學院 藥學院， 浙江 溫州 325035；2.溫州光明醫(yī)院，浙江 溫州 325001；3.溫州醫(yī)學院附屬樂清醫(yī)院 藥劑科， 浙江 溫州 325600）

任何來自環(huán)境、社會、工作、生活、軀體精神、心理的刺激均能使機體處于生理或心理的應激之中。現(xiàn)代文明社會的發(fā)展和高科技對人類生存環(huán)境全方位的滲透，使人類承受著越來越復雜、越來越強烈的生理和心理應激。適當應激可增強人們對外界有害因素的免疫和抗御能力，但持久的應激可導致機體生理功能紊亂，使機體出現(xiàn)學習和記憶功能障礙、抑郁癥、應激性精神紊亂、癡呆等多系統(tǒng)的損壞[1-2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與認知行為功能密切相關的腦區(qū)，富含各種信使受體，尤其是富含糖皮質激素受體，在應激反應中，它不僅是高位調節(jié)中樞，更是受應激累及的最敏感區(qū)域，極易受到高濃度糖皮質激素的攻擊[3]。慢性應激或長期在應激水平糖皮質激素的作用下，會使海馬神經(jīng)元發(fā)生萎縮甚至死亡[4]。cAMP反應元件結合蛋白（CREB）通路的激活介導腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達并促進神經(jīng)元再生。

姜黃素（curcumin)是從姜科植物Curcuma longa L.中提取的一種相對分子質量小的多酚類物質，通常認為它是姜黃中的最有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)和神經(jīng)保護作用[5]。因此本研究采用綜合性交替刺激，建立大鼠慢性應激模型，并觀察其空間學習記憶能力的變化模式，同時從神經(jīng)保護的角度探討姜黃素對慢性應激所致學習記憶障礙大鼠腦內信號轉導通路的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 姜黃素、氟西汀購自美國Sigma公司。姜黃素用花生油溶解，氟西汀用雙蒸水溶解，不同劑量的姜黃素（2.5、5.0和10 mg/kg）和氟西汀（10 mg/kg）分別口服和腹腔注射21d，末次給藥后60min（姜黃素）和30min（氟西?。╅_始實驗。在預實驗中，花生油和雙蒸水用作對照組，兩種溶液對大鼠行為學結果的影響沒有明顯差異。因此，正式實驗選擇花生油作為對照組。兔抗人BDNF多抗、兔抗大鼠CREB、pCREB多抗、ECL發(fā)光底物顯色試劑盒均購自美國SantaCruz公司。

1.2 主要儀器 精密電子天平（FA-1004），上海精科天平廠生產(chǎn)；八臂迷宮；MG-3Y迷宮刺激器（張家港生物醫(yī)學儀器廠）；EPS601型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國Amersham公司)；DYCZ-24D垂直板電泳槽、DYCP-40C型石墨電極水平電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.3 實驗動物 成年雄性SD大鼠48只，體質量180～200 g，購自溫州醫(yī)學院動物中心。飼養(yǎng)條件：4只/籠，室溫（22±1）℃，濕度50%±10%，自然光照，自由攝食飲水。所有動物于飼養(yǎng)環(huán)境中適應7d后開始實驗，實驗前禁食12～16h，食水自由。隨機分為6組（每組8只）：正常對照組、應激模型組、姜黃素組（2.5、5和10 mg/kg）、氟西汀組（10 mg/kg）。

1.4 大鼠慢性應激模型的建立 慢性應激時程共計21d，每日1次，時間：上午9:00-下午2:00之間，應激組每天選取7種刺激中的一種進行刺激：強迫游泳（水溫10 ℃）5 min；制動2 h；夾尾（距尾根1 cm）1 min；禁水（水瓶取掉12 h后，放空瓶1 h，之后恢復正常飲水）；禁食（鼠糧取空12 h后，每籠放3 g鼠糧2 h，之后恢復正常飲食）；足底電擊（1 mA，時程1 s，1次/min）30 min；換籠孤養(yǎng)24 h；刺激時間和形式每天隨機。每日測定體重，于每天實驗前60 min或30 min按體重給予不同劑量的姜黃素（2.5、5、10 mg/kg，p.o.）、花生油或氟西?。?0 mg/kg，i.p.）。第21天進行行為學實驗。

1.5 Y迷宮實驗 Y型電迷路三臂（I、II、III）間的夾角為120°，每一臂尺寸30 cm×8 cm×15 cm（長×寬×高），各臂末端均裝有信號燈。將大鼠放入迷宮刺激器的一臂，適應環(huán)境5 min后給予電刺激（60 V，持續(xù)2 s)。其余兩臂中的任一臂給予燈光信號，示為安全區(qū)。大鼠進入安全區(qū)，為正確反應，否則為錯誤反應。第2次訓練以此安全區(qū)作為起步區(qū)，并使大鼠停留在安全區(qū)1 min以鞏固記憶。再給予電刺激，以此類推，按方向（I-II-III-I）依次改變安全區(qū)位置。開始訓練時，小鼠受電擊逃離起步區(qū)后直接跑向安全區(qū)，或跑向非安全區(qū)，并在電擊作用下最終才跑至安全區(qū)（被動回避反應），故會出現(xiàn)錯誤反應。多次訓練后，安全區(qū)燈亮，電刺激尚未開始時，小鼠立即逃往安全區(qū)，即為形成明暗辨別條件反射（主動回避反應）。測試成績分為學習成績和記憶成績，測試達到連續(xù)10次中有9次（9/10）正確反應前所需的電擊次數(shù)即嘗試次數(shù)表示學習能力[6]；記憶成績以學習完后再電擊10次中正確反應的次數(shù)（n/10）為準，于應激前后記錄測試成績。

1.6 八臂迷宮實驗 八臂迷宮中動物通過觀察周圍一些固定的參照物來學習和記憶自身與餌（置于迷宮臂末端的一顆鼠糧）的相對位置。訓練前大鼠先在迷宮中適應2 d，每天1次。每次訓練中，八臂中只有四臂放置了餌（分別是1、2、4和7號臂），整個實驗過程均維持此順序。大鼠放在迷宮中央?yún)^(qū)，此時中央?yún)^(qū)四周用門關住，15 s后門開放，大鼠可選擇進入任意一臂，以攝取餌。大鼠進人有餌的臂且攝取了餌為一次正確選擇，進入餌臂而未攝取餌或重新進入放餌臂稱為工作記憶錯誤（working memory error，WME），進入不放餌臂稱為參考記憶錯誤（reference memory error，RME），總記憶錯誤（TE）記為WME和RME的總和。共訓練約l0～l5次，連續(xù)5次訓練TE不超過1，且WME為0，認為訓練成功。

1.7 組織蛋白提取與定量 實驗結束后，冰上斷頭取腦，迅速剝離全腦，分離完整的海馬，按照50 mg組織/500μL裂解液的比例冰浴勻漿組織，裂解30 min后超聲處理溶液10 s，裂解液于4 ℃、13000 r/min離心20 min。吸取上清，測定蛋白含量。蛋白定量測定應用考馬斯亮蘭標準定量方法。595 nm下測光密度值。以標準蛋白濃度對光密度值作標準曲線，計算待測樣品蛋白濃度

1.8 檢測指標 Western blot檢測pCREB、BDNF，操作均嚴格按說明書和實驗室要求進行。膠片掃描并用Scionimage 4.02 Beta軟件分析。

1.9 統(tǒng)計學處理方法 蛋白免疫印跡分析和行為學成績均用±s表示，采用單因素方差分析法，組間差異采用Dunnett’s檢驗。

2 結果

2.1 姜黃素對慢性應激大鼠Y迷宮實驗的影響 實驗結果（見表1）顯示，與正常對照組相比，應激模型組大鼠學習所需的嘗試次數(shù)顯著增加（P<0.01），而姜黃素組大鼠學習完成所需訓練次數(shù)均明顯少于應激模型組（P<0.05，P<0.01)；停止訓練后姜黃素大鼠記憶成績明顯高于應激模型組（P<0.05)。

表1 各組大鼠Y迷宮實驗的成績比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠Y迷宮實驗的成績比較（±s，n=8）

與正常對照組比：##P<0.01；與應激模型組比：*P<0.05，**P<0.01

組別 劑量（mg/kg） 學習成績 記憶成績正常對照應激模型姜黃素氟西汀2.5 5 10 10 29.33±4.32 48.00±4.34##44.00±3.89 40.17±4.79*39.00±1.26**37.67±7.03**8.33±1.03 4.67±1.21##6.00±0.89 6.33±1.03*6.50±1.05*7.00±0.63**

2.2 姜黃素對慢性應激大鼠八臂迷宮實驗的影響表2顯示，與正常組相比，應激模型組的TE明顯增多（P<0.001)；2.5 mg/kg姜黃素組的TE減少不明顯（P>0.05)；10 mg/kg姜黃素組和氟西汀組的TE較模型組明顯降低（P<0.01)。

表2 各組大鼠八臂迷宮實驗的成績比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠八臂迷宮實驗的成績比較（±s，n=8）

與正常對照組比：##P<0.01；與應激模型組比：*P<0.05，**P<0.01

組別正常對照應激模型姜黃素氟西汀2.5 5 10 10 2.83±0.75 7.33±2.58##4.83±1.47 4.50±1.38*4.33±0.82**3.67±0.52**劑量（mg/kg）TE

2.3 姜黃素對慢性應激大鼠海馬BDNF表達的影響圖1顯示，蛋白免疫印跡分析結果顯示，慢性應激大鼠海馬中BDNF的表達均明顯下降（P<0.01)，姜黃素和氟西汀慢性給藥拮抗了慢性應激引起的BDNF表達的下調（P<0.01)。

圖1 姜黃素對慢性應激大鼠BDNF在海馬中表達的影響（n=6±s）

2.4 姜黃素對慢性應激大鼠海馬磷酸化的CREB（pCREB）水平的影響 圖2顯示，pCREB變化明顯，慢性應激大鼠額海馬中pCREB的表達水平與正常對照組相比明顯下降（P<0.01），而給予10 mg/kg姜黃素后，海馬中pCREB的表達水平與應激組比較上升（P<0.01），給予氟西汀組的pCREB表達水平也顯著上調（P<0.01）。

圖2 姜黃素對慢性應激大鼠pCREB在海馬中表達的影響（n=6±s）

3 討論

隨著社會的發(fā)展及各方面競爭壓力的增加，人們易產(chǎn)生緊張、抑郁、焦慮等情緒反應。許多資料顯示長期應激可損害健康，引發(fā)疾??；同時影響腦的認知能，包括學習記憶等。目前，應激對腦功能，尤其對學習記憶能力的影響引起了人們極大的關注，并已成為神經(jīng)科學和心理學領域研究的熱點[7]。目前認為，慢性應激減少腦內一些關鍵神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子對于神經(jīng)元的發(fā)育、分化和存活，以及成熟神經(jīng)元發(fā)揮功能是必需的。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種，有研究報道，它是維持神經(jīng)元功能和再生修復及防止神經(jīng)元退行性病變的重要細胞因子[8]。另外其對神經(jīng)元的可塑性也具有一定的影響[9]。以前的研究證明，慢性應激與BDNF表達的下調密切相關，幼年期母愛剝奪的大鼠，在成年后其海馬BDNF的水平降低[10]。慢性應激導致大鼠海馬區(qū)BDNF表達明顯降低，表現(xiàn)為持續(xù)的功能性的BDNF調節(jié)缺陷，可能是因為應激狀態(tài)下，有效的反應能力遭到損害[11]，大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改變和大量丟失、腦內單胺類神經(jīng)遞質含量改變，致其發(fā)生抑郁，同時其介導的空間學習記憶功能顯著下降[12]。本研究通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，慢性應激可引起海馬中BDNF的表達減少，而姜黃素慢性給藥明顯拮抗這種效應。這說明姜黃素能增強抑郁動物的學習記憶能力，其涉及的機制與BDNF的上調有關，影響海馬及前腦皮層神經(jīng)細胞再生及突出可塑性，保護慢性應激引起的海馬和前腦皮層神經(jīng)元的損傷[13]。這一作用與經(jīng)典藥物氟西汀（10 mg/kg，i.p.）相似，提高海馬BDNF水平，促神經(jīng)元再生[14]。應激誘導BDNF下調的確切機制還不清楚，糖皮質激素受體激活后抑制BDNF基因啟動子的轉錄可能起到一定作用，但一些細胞內信號轉導通路可能也參與了這一過程。

相關研究表明，cAMP-CREB信號轉導與應激誘導的BDNF下調有關，這一信號轉導通路在抑郁發(fā)病中受損[15]。CREB具有轉錄激活作用的關鍵在于其Ser133位點的磷酸化，磷酸化后CREB才能與cAMP反應元件（CRE）結合，從而誘導基因轉錄。在實驗中發(fā)現(xiàn)，慢性應激對海馬中總的CREB影響不明顯，但pCREB在應激狀態(tài)下明顯減少，說明應激確實影響了CREB的磷酸化；姜黃素可以拮抗應激狀態(tài)下pCREB的減少。這結果提示慢性應激很可能使腦中cAMP-CREB信號轉導通路受損，阻斷了CREB的磷酸化，使腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達減少，導致學習記憶障礙癥狀的出現(xiàn)；姜黃素可以逆轉慢性應激對大鼠學習記憶的損傷可能與上調cAMP-CREB信號轉導通路，從而影響神經(jīng)元存活及其可塑性機制有關。

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