apelin對(duì)正常及低氧大鼠腸系膜小動(dòng)脈的舒張作用及其機(jī)制

張玉青，申屠楊萍，馬建設(shè)，鄧婕，范小芳，胡良岡，龔永生

（溫州醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心、低氧醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325035）

apelin是新發(fā)現(xiàn)的小分子活性多肽，具有循環(huán)激素、旁/自分泌的功能，其受體為G蛋白耦聯(lián)受體——血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白（putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ）[1]。apelin mRNA在胃腸道、脂肪組織、腦、肺、腎、肝、骨骼肌和心血管系統(tǒng)等多種組織中表達(dá)，在大中血管、冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和右心房?jī)?nèi)膜中都可以檢測(cè)到apelin的表達(dá)[2-3]。apelin對(duì)正常與病變心臟都具有正性肌力、舒張血管、降低血壓的心血管保護(hù)作用[4]。莊紅等[5]發(fā)現(xiàn)apelin對(duì)離體主動(dòng)脈有濃度依賴性舒張作用。我們前期的研究[6]表明apelin對(duì)肺動(dòng)脈主干也有濃度依賴的舒張作用。已知腸系膜三級(jí)小動(dòng)脈在低氧的情況下，也會(huì)發(fā)生血管重構(gòu)。apelin對(duì)低氧大鼠腸系膜小動(dòng)脈是否有舒張作用，其與正常大鼠腸系膜小動(dòng)脈的作用是否有差異性目前均尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用腸系膜三級(jí)小動(dòng)脈環(huán)，觀察apelin對(duì)正常和慢性低氧大鼠腸系膜小動(dòng)脈的舒張作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 apelin-13（以下簡(jiǎn)稱apelin）購(gòu)自英國(guó)Tocris Ins；L-Nω-硝基精氨酸甲酯（Nωnitro-L-argininemethyl ester，L-NAME）為Sigma公司產(chǎn)品；去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）購(gòu)自上海試劑二廠；PSS液（physiological salt solution，mmol·L-1）：NaCl 118.99，KCl 4.69，MgSO4·7H20 1.17，KH2P041.1，CaCl2·2H20 2.50，NaHCO325.00，EDTA 0.03，Glucose 5.50；KPSS營(yíng)養(yǎng)液成分（mmol·L-1）：KCl 123.70，MgSO4·7H20 1.17，KH2P041.18，CaCl2·2H20 2.50，NaHCO325.00，EDTA 0.03，Glucose 5.50。

PowerLab數(shù)據(jù)記錄和分析系統(tǒng)，包括軟件Chart 5.0以及硬件8通道橋式放大器（AD Instruments Co.澳大利亞）；DMT血管張力測(cè)定儀（Wire Myograph System，丹麥）。

1.2 慢性低氧性大鼠模型的復(fù)制 清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào):SCXK（浙）2005-0019]。隨機(jī)均分為正常對(duì)照組與低氧組。將低氧組大鼠置于常壓低氧動(dòng)物飼養(yǎng)艙內(nèi)，艙內(nèi)吸入氣O2濃度為9%～11%，CO2濃度低于3%，每天8 h，每周6 d，連續(xù)4周。正常組除吸入空氣外，其他條件與低氧組相同。

1.3 離體血管實(shí)驗(yàn)[7]大鼠斷頭處死，迅速取出腸系膜上動(dòng)脈，浸入已預(yù)冷的PSS液中，顯微鏡下剝離血管周圍組織。將處理好的血管置入含有5 mL PSS液的37 ℃恒溫DMT浴槽內(nèi)，持續(xù)通入含95% O2和5% CO2的混合氣體，pH保持在7.4。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)脈環(huán)靜息負(fù)荷2 mN，每20 min換液1次，穩(wěn)定0.5 h。以KPSS和NE檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮性。以乙酰膽堿（1×10-5mol·L-1)檢驗(yàn)內(nèi)皮功能，大于75%的認(rèn)為內(nèi)皮完整。一氧化氮合酶（NOS）抑制劑L-NAME（1×10-4mol·L-1）孵育后，以NE（3×10-6mol·L-1）預(yù)收縮血管，收縮穩(wěn)定后累加濃度法加入apelin，繪制apelin舒張的量效曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 以NE（3×10-6mol·L-1）動(dòng)脈環(huán)收縮幅度為100%，計(jì)算apelin的舒張率。結(jié)果以±s表示，組內(nèi)進(jìn)行單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組和低氧組對(duì)NE反應(yīng)性的差異 低氧組經(jīng)過(guò)4周的低氧處理，腸系膜動(dòng)脈對(duì)NE的反應(yīng)，低氧組比正常組低（P<0.05，n=10），見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠腸細(xì)膜動(dòng)脈環(huán)對(duì)NE的不同反應(yīng)

2.2 apelin對(duì)NE預(yù)收縮血管的舒張作用 用3×10-6mol·L-1NE預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后累積濃度地加入apelin，對(duì)照組用PSS加入，在時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行對(duì)照。隨著apelin濃度的不斷增加，腸系膜動(dòng)脈的舒張作用增強(qiáng)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=10），見(jiàn)圖2。

圖2 apelin對(duì)正常大鼠腸細(xì)膜動(dòng)脈環(huán)的舒張作用

2.3 apelin對(duì)正常組與低氧組腸系膜動(dòng)脈舒張作用的差異性 以3×10-6mol·L-1NE預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后濃度累加法加入apelin。apelin能濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮完整內(nèi)皮的血管， 但對(duì)低氧組的舒張更大（P<0.05，n=10），見(jiàn)圖3。

圖3 兩組大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)對(duì)apelin的舒張效應(yīng)

2.4 L-NAME阻斷后，apelin對(duì)正常組與低氧組腸系膜動(dòng)脈舒張功能的差異性 用10-4mol/L的LNAME孵育30 min后，再用3×10-6mol·L-1NE預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后濃度累加法加入apelin。apelin能濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮的血管，但正常組的舒張與低氧組的舒張差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=10），見(jiàn)圖4。

圖4 L-NAME對(duì)apelin舒張大鼠腸系膜動(dòng)脈效應(yīng)的影響

3 討論

內(nèi)源性apelin以旁分泌及自分泌的形式發(fā)揮強(qiáng)有力的擴(kuò)血管效應(yīng)。由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生、釋放的apelin結(jié)合并活化鄰近的APJ受體，通過(guò)活化血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），刺激NO的產(chǎn)生和釋放，從而實(shí)現(xiàn)降壓效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性apelin能濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮完整內(nèi)皮的正常與低氧大鼠的腸系膜小動(dòng)脈，并且apelin對(duì)低氧組的舒張幅度更大。我們認(rèn)為apelin作為一種體內(nèi)正常的活性肽，可能對(duì)肌體的平衡調(diào)節(jié)起著重要作用，當(dāng)機(jī)體處于一種低氧狀態(tài)時(shí)，腸系膜動(dòng)脈上的某種物質(zhì)代償性增加，而這種物質(zhì)參與了apelin的舒張作用，使得apelin對(duì)低氧組腸系膜的舒張更為強(qiáng)烈。張曼等[8]發(fā)現(xiàn)低氧6 h人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，莊紅等[5]發(fā)現(xiàn)在兩腎一夾高血壓大鼠主動(dòng)脈apelin的舒張作用更強(qiáng)，因此，有可能是低氧使得內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)增多，內(nèi)皮細(xì)胞代償性增多，或者apelin代償性增多，使得apelin發(fā)揮更大的舒張效應(yīng)。但也可能是機(jī)體在低氧狀態(tài)下，刺激內(nèi)皮細(xì)胞APJ受體表達(dá)增加，使得apelin的舒血管效應(yīng)增強(qiáng)。要證實(shí)這種推測(cè)有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。Tatemoto等[9]發(fā)現(xiàn)，給大鼠靜脈注射apelin后，平均動(dòng)脈壓降低的同時(shí)伴有血漿中NO濃度上升，給予NOS抑制劑后，apelin的降壓作用被抑制，說(shuō)明apelin可能通過(guò)NO信號(hào)途徑發(fā)揮降壓作用。本實(shí)驗(yàn)用L-NAME阻斷NO通路后，apelin對(duì)正常組與低氧組腸系膜小動(dòng)脈的舒張作用均明顯減弱，兩者差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，apelin作為一種小分子生物活性多肽，對(duì)小動(dòng)脈有舒張作用，且apelin在低氧情況下對(duì)腸系膜動(dòng)脈的舒張作用更強(qiáng)，apelin舒張正常與低氧腸系膜小動(dòng)脈的作用可能與NO途徑有關(guān)。

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