番茄紅素對急性肺損傷大鼠肺毛細(xì)血管膜通透性及骨形態(tài)生發(fā)蛋白-4基因表達(dá)的影響

黃澤清，高浩然，楊 舜，侴偉平

（遼寧省腫瘤醫(yī)院 麻醉科，遼寧沈陽 110042）

番茄紅素對急性肺損傷大鼠肺毛細(xì)血管膜通透性及骨形態(tài)生發(fā)蛋白-4基因表達(dá)的影響

黃澤清，高浩然，楊 舜，侴偉平

（遼寧省腫瘤醫(yī)院 麻醉科，遼寧沈陽 110042）

目的：觀察番茄紅素 （Lyc）對急性肺損傷 （ALI）大鼠肺組織毛細(xì)血管膜通透性及骨形態(tài)生發(fā)蛋白-4（BMP-4）mRNA基因表達(dá)的影響，探討其對ALI的保護(hù)作用。方法：將Wistar大鼠隨機(jī)分成3組：對照組（Ⅰ組）、ALI組（Ⅱ組），ALI+Lyc組（Ⅲ組），每組20只，每組中10只處死前注射伊文思藍(lán)。從模型制備前1周開始，Ⅰ組和Ⅱ組用橄欖油、Ⅲ組用橄欖油稀釋的番茄紅素樹脂（1g/L）以5ml/kg的劑量灌胃，1次/d。制備酸吸入大鼠ALI模型，測定ALI后6h肺毛細(xì)血管通透性、肺濕干質(zhì)量比、肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性及BMP-4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與Ⅰ組比較，Ⅱ組肺組織中伊文思藍(lán)提取量顯著增加（P＜0.01），肺濕干質(zhì)量比值、MPO活性顯著升高（P＜0.05），BMP-4 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組肺組織中伊文思藍(lán)提取量顯著降低（P＜0.05），肺濕干質(zhì)量比值、MPO活性明顯均不同程度降低（P＜0.05），BMP-4 mRNA的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論：番茄紅素降低酸吸入致ALI大鼠的肺毛細(xì)血管通透性、肺濕干質(zhì)量比及肺MPO活性，抑制BMP-4 mRNA表達(dá)，減輕ALI大鼠早期肺泡毛細(xì)血管膜損傷并可能改善后期肺組織的修復(fù)，具有肺保護(hù)作用。

番茄紅素；急性肺損傷；骨形態(tài)生發(fā)蛋白

Author’s addressDepartment of Anesthesiology，Liaoning Province Tumor Hospital，Shenyang 110042，China

反流、誤吸所致急性肺損傷 （acute lung injury，ALI）及由此誘發(fā)的肺部綜合征一直困擾著臨床醫(yī)生，盡管發(fā)生率逐步降低，但一旦發(fā)生仍然缺乏有效的治療手段，其中氧化損傷和基因表達(dá)的改變在病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中扮演著重要角色。番茄紅素（lycopene，Lyc）是一種類胡蘿卜素，具有多種生物活性如清除氧自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞連接和減少淋巴細(xì)胞DNA損傷等[1，2]，目前在食品及美容保健方面得到廣泛研究和應(yīng)用。本研究擬通過觀察番茄紅素預(yù)處理大鼠ALI后肺組織毛細(xì)血管膜通透性及骨形態(tài)生發(fā)蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）mRNA 表達(dá)的改變，探討其在酸吸入致ALI中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PE9600 PCR儀 （美國 Perkin-elmer公司），EPS-300電泳儀（上海天能公司），HP1100高效液相色譜儀（美國Hewlett Packard公司），721A型分光光度計(jì)（重慶儀川）等。番茄紅素樹脂制備參考文獻(xiàn)[3]的兩步溶酶法從新鮮西紅柿中提取，應(yīng)用HPLC法測定其純度，檢測波長472nm，密封、避光保存，使用時(shí)用橄欖油稀釋1g/L，髓過氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所）及伊文思藍(lán)溶液等。

1.2 分組及模型制備

健康Wistar雄性大鼠60只，體重180～220g，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。隨機(jī)分成3組，每組20只，每組中10只處死前注射伊文思藍(lán)：對照組（Ⅰ組）、ALI組（Ⅱ組），ALI+Lyc 組（Ⅲ組）。從模型制備前1周開始，Ⅰ組和Ⅱ組用橄欖油、Ⅲ組用橄欖油稀釋的番茄紅素樹脂（1g/L）以5ml/kg的劑量灌胃，每天1次。腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉，暴露氣管，待大鼠呼吸頻率、有創(chuàng)平均動(dòng)脈壓、心率穩(wěn)定后進(jìn)行如下操作：仰位頸前正中氣管穿刺，Ⅰ組經(jīng)氣管滴入生理鹽水2ml/kg后左右搖動(dòng)大鼠，Ⅱ組和Ⅲ組用同樣的方法滴入31.6mmol/L鹽酸 （pH 為 1.5）2ml/kg建立 ALI模型，以氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）≤40kPa作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)，清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。6h后處死，處死前15min每組取10只按20ml/kg經(jīng)靜脈注入質(zhì)量濃度為20g/L伊文思藍(lán)溶液并標(biāo)記，處死后剖胸取肺組織。

1.3 肺毛細(xì)血管膜通透性測定

取注射伊文思藍(lán)并標(biāo)記大鼠（10只）的一定量肺組織放入4ml/0.5kg/L甲酰胺溶液中浸泡，37℃恒溫水浴 24h，以提取組織中的染料，在620nm處測定光密度值，用單位肺組織中染料提取量（μg/g）來反映毛細(xì)血管通透性；肺濕干質(zhì)量比測定：取一定量未注伊文思藍(lán)大鼠（10只）肺組織，用濾紙吸干表面液體，稱濕質(zhì)量，然后置于80℃烘箱中72h（至質(zhì)量不再改變），稱干質(zhì)量，計(jì)算肺濕干質(zhì)量比值。

1.4 肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性測定

應(yīng)用比色法，按試劑盒說明操作。

1.5 BMP-4 mRNA表達(dá)的測定

取未注伊文思藍(lán)大鼠（10只）肺組織，總RNA采用Trizol一步法提取，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用半定量RT-PCR檢測BMP-4 mRNA表達(dá)的水平。互補(bǔ)DNA用BcaBEST RNA RCR試劑盒合成。 分別量取 2×Bca 1st緩沖液 10μl、MgSO44μl，dNTP 混合物 1μl，Rnase 抑制劑 0.5μl，BcaBEST多聚酶 1μl，oligo dT 引物 1μl，總 RNA 1μl，不含Rnase的 dH2O 1.5μl，共計(jì)每個(gè)樣本 20μl。按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：65℃ 1min，30℃ 5min，65℃30min，8℃ 5min，5℃ 5min終止反應(yīng)。利用如下引物及條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：GAPDH引物為5'-GAA GGG TGG AGC CA-3'（上游）和5'-TGC CAG CCC CGG CA-3（下游），BMP-4引物為5'-AGC CGA GCC AAC ACT-3'（上游）和5'-CTT CTT CTT GGA CCG-3'（下游）；反應(yīng)體系包括MgSO46μl，5×Bca 2nd Buffer 16μl，Bca-optimized Taq 0.5μl， 上游引物 1μl， 下游引物 1μl，dH2O 55.5μl， 共計(jì) 80μl， 然后將反應(yīng)液加入到 20μl cDNA 中；PCR 反應(yīng)條件為：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min循環(huán)30次，72℃擴(kuò)展 5min。取RT-PCR產(chǎn)物10μl用含溴化乙錠的20g/L瓊脂糖凝膠電泳30min（5V/cm），對電泳條帶進(jìn)行光密度掃描定量，用每組BMP-4和GAPDH校正光密度值之比表示BMP-4 mRNA相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 番茄紅素對大鼠肺毛細(xì)血管通透性、肺濕干質(zhì)量比及MPO的影響（n=10，xˉ±s）

表2 番茄紅素對大鼠肺組織BMP-4 mRNA表達(dá)的影響 （n=10， x±s）

2 結(jié)果

表1示，與Ⅰ組比較，Ⅱ組肺組織中伊文思藍(lán)提取量顯著增加（P＜0.01），肺濕干質(zhì)量比值、MPO活性顯著升高（均P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組肺組織中伊文思藍(lán)提取量顯著降低（P＜0.05），肺濕干質(zhì)量比值、MPO活性明顯均顯著降低 （均P＜0.05）。表2和圖1示，與Ⅰ組比較，Ⅱ組BMP-4 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組BMP-4 mRNA的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。

3 討論

胃內(nèi)容物吸入（誤吸）所致的ALI是臨床誘發(fā)成人呼吸窘迫綜合征主要原因之一，死亡率高且缺乏有效的治療手段。目前認(rèn)為，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化和黏附，并基于白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和降解作用所產(chǎn)生的髓過氧化物、氧自由基、彈性蛋白酶等損傷肺泡上皮，導(dǎo)致氣體交換功能下降是這一病理過程的基礎(chǔ)[4，5]。我們的研究結(jié)果顯示，與對照組相比，ALI組肺組織中伊文思藍(lán)提取量顯著增加，肺濕干質(zhì)量比值、MPO活性顯著升高；而番茄紅素組肺組織中伊文思藍(lán)提取量顯著降低，肺濕干質(zhì)量比值、MPO活性均不同程度降低。番茄紅素是天然單線態(tài)氧淬滅劑和氧自由基清除劑，抗氧化能力是β-胡蘿卜素的2倍，維生素E的100倍。說明番茄紅素的應(yīng)用明顯改善酸吸入致ALI后肺通透性，減輕肺損傷，對肺泡毛細(xì)血管膜損傷也具有保護(hù)作用。

我們的研究結(jié)果顯示，BMP-4 mRNA的表達(dá)水平在ALI組顯著上調(diào)；而番茄紅素組BMP-4 mRNA的表達(dá)水平受到顯著抑制。BMP-4是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）超家族的成員之一，作用廣泛而復(fù)雜[6，7]，ALI大鼠支氣管上皮細(xì)胞的破壞使上皮-間充質(zhì)模式單位激活，啟動(dòng)損傷修復(fù)程序，這個(gè)過程需要BMP-4、表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、前列腺上皮源性轉(zhuǎn)錄因子（PDEF）及胰島素樣生長因子（IGF）等的參與，它們之間的平衡決定了修復(fù)的結(jié)果是接近正常的上皮還是斑痕纖維化。說明番茄紅素通過改變BMP-4 mRNA的表達(dá)，具有調(diào)節(jié)酸吸入致ALI后肺組織修復(fù)的作用。

綜上所述，我們把具有抗氧化作用的番茄紅素應(yīng)用于ALI大鼠，不僅表現(xiàn)出對ALI大鼠早期肺泡毛細(xì)血管膜損傷的保護(hù)作用，而且可能改善ALI后肺組織的修復(fù)。但目前對臨床ALI病例應(yīng)用抗氧化劑種類、劑量及應(yīng)用時(shí)機(jī)的選擇還有待進(jìn)一步的研究。

[1]WaliszewskiKN，Blasco G.Nutraceuticalpropertiesoflycopene[J].Salud Publica Mex，2010，52（3）：254-265.

[2]Chalabi N，Delort L，Satih S，et al.Immunohistochemical expression of RARalpha，RARbeta，and Cx43 in breast tumor cell lines after treatment with lycopene and correlation with RT-QPCR[J].J Histochem Cytochem，2007，55（9）：877-883.

[3]趙文軍，吳雪萍，高林，等.番茄紅素的簡便提取與貯藏穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué)，2005，26（7）：152-154.

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[7]Ducy P，Karsenty G.The family of bone morphogenetic proteins[J].Kidney Int，2000，57：2207-2214.

Effects of lycopene on pulmonary capillary permeability and gene expression of bone morphogeneticprotein-4 after acute lung injury in rats

HUANG Ze-qing，GAO Hao-ran，YANG Shun，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2011 Dec，25（6）：351－353

Objective：To observe the effects of lycopene （Lyc）on pulmonary capillary permeability and gene expression of bone morphogenetic protein-4（BMP-4）mRNA after acute lung injury（ALI）in rats and investigate the protection of lycopene on ALI.Methods：Sixty rats were randomly divided into 3 groups：control group（Ⅰ），ALI group（Ⅱ）and ALI+Lyc group（Ⅲ）.Animal models of ALI induced by HCL inhalation in rats were made to determine the capillary permeability，lung wet/dry weight ratio，myeloperoxidase （MPO）acticity of lung tissue after 6h and the changes of the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue.Results：Compared with groupⅠ，in groupⅡ，extraction of Evans blue in lung tissue increased very obviously （P＜0.01），lung wet/dry weight ratio，MPO of lung tissue increased obviously（P＜0.05），the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue up-regulated obviously（P＜0.05）.Compared with groupⅡ，in group Ⅲ，extraction of Evans blue，lung wet/dry weight ratio，MPO of lung tissue decreased obviously （P＜0.05），the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue downregulated obviously（P＜0.05）.Conclusion：Lycopene show a marked reductive effect on the capillary permeability，lung wet/dry weight ratio，MPO activity of lung tissue and suppress the up-regulation of the expression of BMP-4 mRNA，relieve capillary membrane injuries during prophase and may improve the restoration of lung tissue during anaphase of ALI in rats，has protective effects on lung in ALI rats.

lycopene；acute lung injury；bone morphogenetic protein-4

R364.5

A

1001-0025（2011）06-0351-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2011.06.009

遼寧省博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（20091042）

黃澤清（1973-），男，醫(yī)學(xué)博士。

2011-08-16

2011-09-05