超聲激活血卟啉對癌性胸腔積液小鼠的臨床意義的實(shí)驗(yàn)研究

錢東華,錢 明,李 洋,呂曉紅*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院）

癌性胸腔積液是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病,目前臨床上沒有一種確切而有效的方法治療此病。本實(shí)驗(yàn)研究是為尋找治療癌性胸腔積液的更有效的方法,為患者解除痛苦,延長壽命。血卟啉(hematoporphyrin,HP）是提取自血液的一種有機(jī)光敏物質(zhì),由于HP類化合物與癌細(xì)胞蛋白結(jié)合或被癌組織的巨噬細(xì)胞吞噬,且癌組織血管的高通透性等原因,該類化合物能夠在腫瘤組織中選擇性潴留,同時(shí)也可被電磁輻射激活,在腫瘤組織內(nèi)誘發(fā)一系列的氧化反應(yīng),從而殺傷癌細(xì)胞起到治療作用。目前國內(nèi)外少數(shù)學(xué)者已有對超聲激活HP對腹水瘤細(xì)胞研究,且證實(shí)超聲激活HP對腹水瘤細(xì)胞有殺傷作用,而對癌性胸腔積液的治療作用尚無人研究。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。尋找癌性胸腔積液治療的更優(yōu)化的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Lewis肺癌細(xì)胞株,吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室保存;C57BL/6純系小鼠,購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物室;血卟啉二鹽酸鹽,粉劑Sigma公司產(chǎn)品;小牛血清,杭州四季青;1640培養(yǎng)液,GIBCO公司出品;MTT DMSO,Sigma公司產(chǎn)品;超聲儀 Aloka5500產(chǎn)自日本。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存 Lewis均為貼壁細(xì)胞,從液氮取出凍存的細(xì)胞后立即置于37℃水浴中溶解。1 000 r/min離心5min,棄上清加入1640培養(yǎng)基離心洗滌一次。加入含10%1640培養(yǎng)基5 ml懸浮起細(xì)胞后置于25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵箱過夜,次日更換一次培養(yǎng)液,以后常規(guī)每3-4天更換一次培養(yǎng)液,待細(xì)胞長至80%-90%融和時(shí),棄去培養(yǎng)基,加0.25%胰酶500 μ l 37℃消化3 min后,加入5 ml培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液于1∶3傳代分裝培養(yǎng)或凍存。

1.2.2 血卟啉二鹽酸鹽(HP）及細(xì)胞懸液的配制①用1640培養(yǎng)基將血卟啉二鹽酸鹽(HP）配成5 mg?L-1、10 mg?L-1、20 mg?L-1濃度溶液;②取細(xì)胞懸液,在細(xì)胞計(jì)數(shù)版上計(jì)數(shù),用1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至2×105/ml。

1.2.3 癌性胸腔積液動物模型的制備 ①取生長狀態(tài)良好的約80%-90%融合的Lewis細(xì)胞,收集細(xì)胞并計(jì)數(shù),用生理鹽水重懸成2×106個(gè)細(xì)胞/100 μ l,立即 進(jìn)行 接種,取 100 μ l細(xì) 胞懸 液皮 下注C57BL/6小鼠背部皮下,約7天左右開始成瘤,待生長至最大直徑達(dá)到1-2 cm后,再進(jìn)一步造模;②制備單細(xì)胞懸液:取生長良好Lewis細(xì)胞荷瘤小鼠,在無菌條件下剝離腫瘤細(xì)胞,剔除血塊、脂肪,從中心剖開,觀察生長情況。取生長良好,沒有明顯中心壞死的腫瘤組織,并用PBS反復(fù)沖洗。用無菌剪刀剪切為2mm見方的腫瘤組織,然后放人無菌細(xì)胞研磨器中,加生理鹽水2-4 ml,研磨為細(xì)胞勻漿,篩網(wǎng)過濾后用加生理鹽水2-4 ml,放人離心機(jī)800轉(zhuǎn)/分,離心10min反復(fù)2次。用Trypan Blue拒染法確定細(xì)胞活力,要求活細(xì)胞在95%以上,調(diào)整活細(xì)胞數(shù)為1×106/ml。;③模型制備:取雌性、4-5周齡、體重 14-18 gC57BL/6純系小鼠,用26號細(xì)針通過第5肋間向每只小鼠右側(cè)胸腔注入單細(xì)胞懸液0.2 ml。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及治療 取雌性、4-5周齡、體重14-18 g的造模后的C57BL/6純系小鼠40只,其中10只為健康對照組,其余30只制備完癌性胸腔積液動物模型后,隨機(jī)分成3組,分別為A:血卟啉(HP）治療組:HP濃度為10 mg?L-1,腹腔注射0.2 ml、分別于第 1、3、5、7 天行超聲照射。B:順鉑(DDP）組、按照6 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射0.2 ml DDP,分別于第 1、3、5、7 天各一次,共 4 次;C:生理鹽水治療組:小鼠腹腔注射0.2 ml生理鹽水,分別于第 1、3、5、7 天各一次,共 4 次 ;D:健康對照組:10只以同等重量的未接種腫瘤的裸小鼠作為健康對照組。以上小鼠均在無菌清潔地方飼養(yǎng)。溫度控制在25±2℃。

1.2.5 觀察指標(biāo) 治療3周期間觀察小鼠基本生存情況如呼吸、皮膚顏色、運(yùn)動等情況。

小鼠體重 造模后每日在固定時(shí)間用電子稱測量每只小鼠的體重,精確到0.01 g,資料存人EXCEL備檢驗(yàn)。

小鼠攝食每日上午8-9時(shí)定量給予每組小鼠飼料,24 h測量盒內(nèi)剩余的飼料量,計(jì)算小鼠的飼料攝取量,精確到0.01 g(飼料攝取量=前1天飼料重量-次日測得飼料量）。

癌細(xì)胞浸潤范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖三組動物,觀察癌細(xì)胞在胸腔浸潤范圍(肺、胸膜、縱隔淋巴結(jié)、心包 、肝 、胃 、腹腔淋巴結(jié)）。

生存期 從接種瘤細(xì)胞的第一天起開始計(jì)算觀察動物的生存時(shí)間。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)存入計(jì)算機(jī)EXCEL,用SPSSl0.O軟件根據(jù)資料性質(zhì),分別采用參數(shù)或非參數(shù)等級資料比較法,計(jì)算各組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重

全部小鼠體重在第一周都有不同程度地上升,隨著時(shí)間的推移,腫瘤生長,小鼠的體重和對照組比較明顯降低。在第8天體重和對照組出現(xiàn)明顯差異。在第10天左右,實(shí)驗(yàn)組小鼠體重有所恢復(fù),和對照組體重相比出現(xiàn)差異。隨著治療的繼續(xù),到15天兩者體重在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有非常顯著差異(P＜0.001）。從第8天起血卟啉(HP）治療組與健康對照組一直存在差異,說明治療不能使體重完全恢復(fù)。DDP組和生理鹽水治療組體重曲線重疊,但是到達(dá)25天后DDP組出現(xiàn)體重恢復(fù),但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能和治療后無效死亡有關(guān)(圖1）。

圖1 各組小鼠體重變化

2.2 小鼠攝食比較

血卟啉(HP）治療組在治療前和其他接種組沒有差異,治療3天后,攝食較生理鹽水組、順鉑組提高,隨著治療時(shí)間延長,食物攝取逐步提高,當(dāng)治療到第10天,較生理鹽水組提高約25%,累積食物攝取曲線出現(xiàn)明顯分離,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有非常明顯差異(P＜0.001）(表2）。

表2 治療后第10天每組小鼠攝食比較(單位:g,±s）

表2 治療后第10天每組小鼠攝食比較(單位:g,±s）

健康對照組、HP組分別和其他各組比較P值都＜0.01

分組 n x— ±s P 值生理鹽水組 10 44.400 5±4.801 2健康對照組 10 55.152 7±5.972 1 0.000 DDP組 10 41.463 5±9.256 0.087 HP組 10 50.584 2±5.336 5 0.000

2.3 各組動物生存狀況和胸腔癌細(xì)胞浸潤范圍

各組動物造模后第10天開始,陸續(xù)有動物出現(xiàn)呼吸困難,以生理鹽水對照組明顯,發(fā)生數(shù)量較多,HP組和DDP組發(fā)生數(shù)較少,動物懶動,皮膚顏色較健康對照組發(fā)暗,造模后第20天三組大部分動物都發(fā)生呼吸困難,皮膚發(fā)紺,消瘦明顯,動物倦臥懶動。但HP組的發(fā)生數(shù)量和程度都輕于其他兩組。胸腔癌細(xì)胞浸潤范圍評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):無轉(zhuǎn)移者為(-）;有1-3個(gè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)者為(+）;3個(gè)及以上者為(++）。解剖胸腔發(fā)現(xiàn),三組動物都有胸腔轉(zhuǎn)移,大多轉(zhuǎn)移到心包、肺、縱隔胸膜、縱隔淋巴結(jié),但所有動物在腹腔都沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。根據(jù)轉(zhuǎn)移的多少衡量轉(zhuǎn)移的程度,經(jīng)Ridit分析,HP組與生理鹽水對照組比轉(zhuǎn)移到心包、肺、縱隔淋巴結(jié)的程度有顯著性差異(P＜0.05）;HP組與DDP組比無顯著差異(P＞0.05）。

2.4 生存期

三組動物的中位生存時(shí)間,生理鹽水對照組為31天,DDP組為36天,HP組為43天。HP組中位生存時(shí)間明顯長于順鉑治療組(P＜0.01）,說明HP治療能延長模型小鼠的生存時(shí)間。

3 討論

癌性胸腔積液是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病,目前臨床上沒有一種確切而有效的方法治療此病。

血卟啉(hematoporphyrin,HP）是提取自血液的一種有機(jī)光敏物質(zhì),由于HP類化合物與癌細(xì)胞蛋白結(jié)合或被癌組織的巨噬細(xì)胞吞噬,且癌組織血管的高通透性等原因,該類化合物能夠在腫瘤組織中選擇性潴留,同時(shí)也可被電磁輻射激活,在腫瘤組織內(nèi)誘發(fā)一系列的氧化反應(yīng),從而殺傷癌細(xì)胞起到治療作用。

Date M,等[1]研究發(fā)現(xiàn),HP被激活后作用靶位除了細(xì)胞膜系統(tǒng)外,還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。國內(nèi)研究也證實(shí)了HP被激活后通過誘導(dǎo)凋亡對體外培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549產(chǎn)生殺傷作用[2]。

Umemura et al.提出,并初步證明超聲不僅能激活血卟啉,且具有抗癌效果,這種方法稱為聲動力療法(Sonodynamic therapy,SDT）。國內(nèi)外少數(shù)學(xué)者已有對超聲激活HP對腹水瘤細(xì)胞研究[3-4],且證實(shí)超聲激活HP對腹水瘤細(xì)胞有殺傷作用,而對癌性胸腔積液的治療作用尚無人研究。這一新型的腫瘤治療方法將逐步過渡到臨床,使之成為有效治愈腫瘤的新療法。

超聲激活血卟啉在治療小鼠的癌性胸腔積液的方面我們首次做了一定的工作,從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲激活血卟啉能對癌性胸腔積液小鼠體重的下降有控制作用,抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散,改善癌性胸水小鼠的攝食狀態(tài),提高小鼠的生存期,超聲激活血卟啉在治療胸腔積液的同時(shí)對胸痛、呼吸困難也有明顯的緩解作用,能夠提高小鼠的生活質(zhì)量。此實(shí)驗(yàn)有待于進(jìn)一步應(yīng)用臨床工作中,給癌性胸腔積液的病人帶來光明。

[1]Date M,Fukuchik,Namiki Y,et al.Therapeutic effect of photodynamic therapy using PAD-S31 and diode laser on human liver cancercell[J].LiverInt,2004,24(2）:142.

[2]孫燕妮,李強(qiáng),姚小鵬,等.光動力療法對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549殺傷作用的研究[J].中國肺癌雜志,2004,7(5）:396.

[3]Umemura K,Yumita N,et al.Sonodynamically induced antitumor effect of pheophorbidea[J].Cancer Lett,1996,102(1-2）:151.

[4]Liu,Q.H.,et al.Study of cell killing on S180 by different intensity ultrasound activate hematoporphyrin derivatives[J].Science in china(Scries C）,2002,32(5）:454.