cTnI、Mb聯(lián)合應(yīng)用評價異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血損傷及凋亡發(fā)生

袁 瑾,李娜娜,李文花,鮮春波

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,貴州遵義 563003）

心肌缺血性損傷,特別是急性心肌梗塞(AMI）是嚴(yán)重威脅人類生命的主要疾病之一,肌酸激酶(CK）、肌酸激酶同工酶(CK-MB）一直是診斷急性心肌梗塞(AMI）的重要指標(biāo),尤其是CK-MB常作為診斷(AMI）的“金指標(biāo)”[1],但CK、CK-MB的測定存在診斷特異性差、早期診斷靈敏度不高、診斷窗口時間短等不足。血清肌鈣蛋白I(cTnI）是心臟的結(jié)構(gòu)蛋白,由于它在個體發(fā)育的各個階段均不在骨骼肌中表達(dá),使其成為心肌損傷最敏感、。最特異的血清標(biāo)志物之一,具有診斷窗口期寬、診斷閾值明確及測定快速等優(yōu)點(diǎn),目前認(rèn)為cTnI是檢測心肌損傷的理想指標(biāo)[2]。血清中的肌紅蛋白(Mb）來自骨骼肌或心肌組織的損傷。是一種相對分子質(zhì)量為18×103的蛋白,在心肌壞死的早期釋放入血,Mb診斷AMI的早期敏感性高、快[3]。Mb在血中出現(xiàn)時間早與其分子量很小、能迅速自缺血損傷部位釋放進(jìn)入血液循環(huán)有關(guān),助于超急性期入院患者和溶栓后再灌注的及時診斷[4]。本研究用異丙腎上腺素制造大鼠心肌缺血模型,通過對cTnI和Mb的檢測并與CK、CKMB對比,來反映心肌缺血的程度,對其敏感性和特異性做出評價,同時檢測缺血時心肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象,觀察細(xì)胞凋亡對心肌缺血的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象健康Wistar大鼠32只,雌雄不限,體重約150 g,由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,隨機(jī)分為4組;正常對照組(腹腔注射生理鹽水10 mg/kg即第1組）、低劑量組(腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素5 mg/kg即第2組）、中劑量組(腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素10 mg/kg即第3組）、高劑量組(腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素2 0mg/kg即第4組）。

1.2 試劑cTnI測定試劑盒(美國ADA公司）,Mb測定試劑盒(美國ADA公司）,CK、CK-MB測定試劑盒(日本奧林巴斯公司）,鹽酸異丙腎上腺素(上海禾豐有限公司）,細(xì)胞凋亡試劑盒(博士德）,DAB顯色試劑盒(博士德）。

1.3 心肌缺血大鼠模型的建立按5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg計算每組大鼠所需注射鹽酸異丙腎上腺素的量 ,別為 1.5 ml、3.0 ml、6.0 ml,正常對照組按10 mg/kg注射生理鹽水3.0 ml。注射后16小時做心電圖觀察,出現(xiàn)ST段明顯抬高,表示心肌梗塞大鼠模型復(fù)制成功,將典型心電圖保存。各組大鼠摘眼球取血3 ml左右,置于普通試管中,以3 000 rpm的速度離心10 min,取血清-20℃保存。

1.4 方法cTnI與M b的檢測采用酶聯(lián)免疫(ELISA）法;CK、CK-MB用奧林巴斯AU2700生化分析儀檢測血清中CK、CK-MB的含量;細(xì)胞凋亡的檢測:制備石蠟切片,進(jìn)行免疫組化染色,選取相應(yīng)部位,細(xì)胞計數(shù)在100倍高倍視野,用標(biāo)準(zhǔn)的10×10目鏡欄珊計數(shù),共計數(shù)10個視野,結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的平均百分比表示。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,均數(shù)以 ˉx±s表示,組間比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌缺血模型的制造腹腔注射不同劑量(5、10、20 mg/kg）鹽酸異丙腎上腺素的大鼠,其心電圖的ST段明顯抬高,表明大鼠腹腔注射不同劑量的酸異丙腎上腺素后,發(fā)生了不同程度的心肌缺血,而且隨著劑量的增大,大鼠心肌缺血越嚴(yán)重并出現(xiàn)梗塞,說明模型建立成功。急性心肌梗塞的壞死型Q波深度大于同一導(dǎo)聯(lián)R波的1/4,寬度≥0.04秒。

2.2 cTnI、Mb與 CK、CK-MB的檢測見表1。

表1 心肌缺血大鼠血清中 cTnI、Mb的含量,及與 CK、CK-MB比較

2.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

2.3.1 免疫組化染色結(jié)果 對照組未見棕黃色凋亡顆粒,低劑量組可偶見。中劑量組可見到大片明顯的棕黃色顆粒,并在心肌組織中分布較均勻,高劑量組的棕黃色顆粒顏色加深且聚集成團(tuán)。

2.3.2 小血管表現(xiàn) 在檢測中我們發(fā)現(xiàn)小血管的內(nèi)皮細(xì)胞在中高劑量組可見到明顯的凋亡,橫切面上棕黃色顆粒呈連續(xù)性的環(huán)狀排列。在小血管周圍的心肌組織中也散在分布有棕黃色凋亡顆粒。

2.3.3 凋亡細(xì)胞計數(shù)結(jié)果,見表2。

表2 心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡(±s,n=10）

表2 心肌缺血模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡(±s,n=10）

注:與對照組比較,*P＜0.05

組別 劑量/mg?kg-1 凋亡細(xì)胞百分率/%空白對照組 0 0.5±0.76低劑量模型組 5 mg/kg 5.13±2.53*中劑量模型組 10 mg/kg 5.63±1.60*高劑量模型組 20 mg/kg 10.00±3.63*

3 討論

肌鈣蛋白(troponin,Tn）由3種亞基組成,是橫紋肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白[5],其中TnC為Ca2+結(jié)合亞基[6],TnT為原肌球蛋白結(jié)合亞基[7],TnI為抑制亞基[8],心肌肌鈣蛋白I具有高度的心肌特異性,相對于兩種骨骼肌亞型約有40%的不同源性,其氨基末端比慢骨骼肌亞型(sTnI）多31個氨基酸殘基[9]是心肌損傷最特異、敏感的標(biāo)志物之一。本研究觀察了大鼠發(fā)生不同程度的心肌梗塞后血清中cTnI、CK、CK-MB蛋白的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌受損的各個階段,血清中cTnI的含量均明顯升高,升高的倍數(shù)均大于CK、CK-MB,表明在心肌梗塞各個階段檢測血清中cTnI的含量,其靈敏性均高于CK、CK-MB。

Mb分子量小并且直接接觸于細(xì)胞膜,對膜通透性改變反應(yīng)靈敏,膜破裂后能迅速逸出細(xì)胞。但Mb并非心肌所特有,如同時伴有肌肉損傷和腎衰時,最好于發(fā)病后4-6 h再次同時檢測Mb與cTnI,以作鑒別診斷。本研究中Mb隨心肌缺血嚴(yán)重程度的加深而升高,與CK、CK-MB相比,各組間數(shù)值差異明顯,敏感性較強(qiáng),與cTnI結(jié)合表現(xiàn)除較好的特異性。

凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動內(nèi)部機(jī)制,主要表現(xiàn)為內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過程[10]。然而心肌細(xì)胞同樣存在凋亡現(xiàn)象,缺血性心肌細(xì)胞死亡的方式之一就是細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡先于細(xì)胞壞死出現(xiàn),在缺血早期心肌細(xì)胞主要是通過凋亡的方式喪失的,是心肌缺血早期細(xì)胞死亡的主要形式[11]。心肌細(xì)胞凋亡不僅是擴(kuò)大心肌梗死范圍的一個獨(dú)立因子,而且參與到梗死的病理過程。我們的研究發(fā)現(xiàn),隨著異丙腎上腺素劑量的增大,心肌細(xì)胞凋亡的程度逐漸加深。我們把每張切片取10個視野,分別計數(shù)每個視野中所有的細(xì)胞數(shù)及調(diào)亡的細(xì)胞數(shù),然后計算調(diào)亡細(xì)胞指數(shù)(apopototic index AI）。AI=10個視野調(diào)亡細(xì)胞總數(shù)/10個視野計數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。隨著異丙腎上腺素劑量的增大,調(diào)亡指數(shù)逐漸增大(見表2）。而異丙腎上腺素劑量越大,心肌細(xì)胞缺血越嚴(yán)重,調(diào)亡指數(shù)又是反映細(xì)胞調(diào)亡程度的指標(biāo)。因此表2說明隨著心肌缺血程度的加重,大鼠心肌細(xì)胞調(diào)亡也隨之加深。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)小血管凋亡現(xiàn)象明顯,懷疑血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺血情況下凋亡明顯,可能會在早期影響心肌細(xì)胞供血,可能是細(xì)胞壞死凋亡的原因之一,是否可能導(dǎo)致其他一些情況發(fā)生,還需進(jìn)一步研究。

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