長(zhǎng)春地區(qū)RhD(-）基因型分析

于曉麗,焦立新

(長(zhǎng)春市中心血站,吉林 長(zhǎng)春 130033）

Rh血型是目前被國(guó)際輸血協(xié)會(huì)(ISBT）認(rèn)定的29個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最具復(fù)雜性和多態(tài)性的血型系統(tǒng),它是繼ABO血型發(fā)現(xiàn)后臨床意義最大的一個(gè)血型。主要抗原有D、C、c、E、e,其中D 抗原具有高度免疫原性,最具臨床意義[1]。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象長(zhǎng)春地區(qū)隨機(jī)抽取Rh陰性獻(xiàn)血者血樣60名。

1.2 間接抗人球試驗(yàn)確認(rèn)RhD(-）血液

將60名陰性獻(xiàn)血者的血樣編號(hào)1-60,將其洗滌三次后配成5%紅細(xì)胞懸液,各取1滴加入試管中,再向試管中加入2滴IgG的抗D試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限公司）,37℃孵育30分鐘。孵育30分鐘后用生理鹽水反復(fù)洗滌3次。棄盡上清,再向試管中加入廣譜抗人球蛋白試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限公司）,1000轉(zhuǎn)1分鐘離心,觀察結(jié)果,有凝集者為RhD(+）,無(wú)凝集者為RhD(-）[2]。

1.3 基因組DNA提取

使用invitrogen DNA Isolation Kit(invitrogen Corporation,Wisconisin,USA）Lot:038 Batch:46481,按照說(shuō)明書流程操作,從全血中提取基因組DNA。

1.4 序列特異性引物PCR(sequence-specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP）-瓊脂糖凝膠電泳

1.4.1 2.5%瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備 將2.5 g瓊脂糖加入100 ml×TBE溶液(Tis-硼酸鹽-EDTA溶液）,加熱直到形成均勻的凝膠溶液。再加入5 μ l EB,混合均勻。將混合好的凝膠溶液倒入凝膠槽內(nèi),插入電泳梳,待冷卻后拔出電泳梳備用。

1.4.2 序列特異性引物PCR 篩選RHD(-）血液標(biāo)本基因型采用天津秀鵬生物科技有限公司生產(chǎn)的特異性引物(引物包被在引物板上）,特異性檢測(cè)RHD基因的第1、5、6、7外顯子和845A/G 和1227A/G等位基因。一份樣本檢測(cè)4個(gè)外顯子和4個(gè)等位基因。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μ l。含5 U Taq聚合酶(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）,200 μ mol/L dNTPs,模板 DNA 10 μ l(80-100 ng/μ l）。 在BIO-RAD iCycler DNA擴(kuò)增儀96℃預(yù)變性2 min,隨后96℃變性20 s,64℃退火50 s,72℃延伸45 s共32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

1.5 分析擴(kuò)增條帶

2 結(jié)果

2.1 間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果在60名Rh陰性獻(xiàn)血者中RhD(-）標(biāo)本60例。

2.2 PCR-SSP結(jié)果在60例RhD(-）樣本中,1名為 DVIⅢ型 、5名為弱D15、7名為1227DEL、9名RHDCE(2-9）-D、38名為真正的RHD基因缺失(表1）。

表1 60例RhD(-）標(biāo)本PCR擴(kuò)增條帶分析

圖1 RHD基因外顯子和等位基因的PCR-SSP檢測(cè)結(jié)果

3 討論

Rh血型系統(tǒng)是能引起輸血反應(yīng)和新生兒溶血反應(yīng)的重要血型系統(tǒng)。其主要有D、C、c、E、e五種抗原,以D抗原為最強(qiáng),往下依次是E、C、c、e[3]。起初基于白種人的研究認(rèn)為,RhD(+）者紅細(xì)胞表面存在D抗原,而RhD(-）者紅細(xì)胞表面不存在D抗原。但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)在非洲黑人、澳大利亞人、日本人中一些 RhD(-）者存在部分或完整的D抗原[4],它的產(chǎn)生涉及復(fù)雜的基因變化。這種含有極弱D抗原的RhD(-）血液輸注到真正RhD(-）即RHD基因缺失患者的體內(nèi)就會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生抗D抗體。當(dāng)再次輸注這樣的血液后,就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)。因此對(duì)其基因的變化及分布規(guī)律進(jìn)行深入研究具有重要意義。

RH基因由RHD基因和RHCE基因兩個(gè)組成,它們各含有10個(gè)外顯子。RHD基因編碼D抗原,RHCE基因編碼C和E抗原。起初認(rèn)為RhD(+）者攜帶 RHD基因和RHCE基因,而RhD(-）者只有RHCE基因而無(wú)RHD基因存在。但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)一些東方人群中,RhD(-）者紅細(xì)胞表面存在部分或完整的RHD基因[5]。這種RhD變異體的形成涉及了復(fù)雜的分子生物學(xué)變化,主要為 RHD和RHCE等位基因發(fā)生融合、細(xì)胞外環(huán)錯(cuò)義突變、外顯子缺失和等位基因被替換等機(jī)制[6-9]。經(jīng)研究證明這些RhD的變異表型主要包括弱D、部分D和DEL型。在中國(guó)人群中,尤以弱D15、RHD-CE(2-9）-D、1227DEL較常見(jiàn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):利用12種單克隆抗體對(duì)2名弱D15的個(gè)體做抗原表位檢測(cè),發(fā)現(xiàn) 5種克隆抗體顯現(xiàn)陰性反應(yīng),包括LHM174/102、LHM77/64、LHM70/45、LHM59/19、LHM57/17,這說(shuō)明弱D15型人紅細(xì)胞表面存在第1、8、9抗原表位的缺失[10-11]。還有學(xué)者對(duì)弱D15型人的RHD基因的第6號(hào)外顯子進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在6號(hào)外顯子上均存在堿基突變845G〉A(chǔ),編碼序列其它部分與正常 RHD序列相同[5]。RHD-CE(2-9）-D主要是由于RHD基因的第2-9號(hào)外顯子被RHCE基因所替換,導(dǎo)致不能編碼正常的RhD蛋白,形成個(gè)體D抗原陰性表型[12]。DEL等位基因均是由1個(gè)核苷酸突變所引起的。DEL的遺傳背景在中國(guó)人和歐洲白人之間存在明顯差異。中國(guó)漢族人群中最為常見(jiàn)以及在過(guò)去很長(zhǎng)時(shí)間的報(bào)道中表明中國(guó)漢族人群中只存在這種等位基因RHD1227A[13]。

60例RhD(-）樣本經(jīng)PCR-SSP實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出:1例DVIⅢ型、5例弱D15 、7例1227DEL、9例 RHDCE(2-9）-D、38例RHD基因缺失[即為真正的RhD(-）]。其中RHD基因缺失所占陰性血液比率的63.33%,長(zhǎng)春與云南等地區(qū)RHD基因缺失所占陰性血液比率沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05）;RHD-CE(2-9）-D型所占陰性血液比率的15%,與2002年和2003年國(guó)內(nèi)學(xué)者檢測(cè)到的比率12%很接近[7,14]。說(shuō)明這種表型的RhD(-）血液在國(guó)內(nèi)還是比較常見(jiàn)的。1227DEL所占陰性血液比率的11.67%,與上海、新疆、日本地區(qū)比較無(wú)顯著性差異[15-16]。但是與臺(tái)灣、海南等地區(qū)差異較大[17-18]?；窘咏趪?guó)內(nèi)大部分地區(qū)。本實(shí)驗(yàn)檢出1例DVIⅢ型,它形成的分子生物學(xué)機(jī)制是:RHD基因的第3-6號(hào)外顯子被RHCE基因所取代產(chǎn)生融合基因,使得D抗原表達(dá)很弱,很不易被檢出。此型一般多見(jiàn)于白種人和日本人,中國(guó)人群比較少見(jiàn)[1]。

由于目前RhD(-）基因變化尚處在研究階段,對(duì)于RhD(-）表型血液臨床應(yīng)用還沒(méi)有具體定論。但RhD(-）表型血液在臨床有其重要意義。RhD(-）表型的血液一直被當(dāng)作RhD(-）血使用。這種表型RhD(-）血液的輸注方式,對(duì)于真正的RhD(-）患者存在潛在的危險(xiǎn),因?yàn)檫@種血液紅細(xì)胞表面的極弱D抗原可能誘發(fā)RhD(-）患者產(chǎn)生抗D,從而增加溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生率;對(duì)于RhD(-）女性患者,輸注這種血液,懷孕后發(fā)生新生兒溶血病的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。另一方面,RhD(-）表型患者輸注真正的RhD(-）血?jiǎng)t意味著血液資源的巨大浪費(fèi)。因此,研究準(zhǔn)確的RhD(-）基因的定型方法,對(duì)臨床輸血安全有重要意義。

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