強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的檢測及其臨床意義

馬學(xué)華,張 萱,張 娜,趙 宇,宋麗婷

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江哈爾濱150001)

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種慢性自身免疫性疾病,主要累及髂骶關(guān)節(jié)、脊柱、骨軟骨組織及四肢關(guān)節(jié),表現(xiàn)為脊柱和髂骶關(guān)節(jié)疼痛、活動障礙、畸形、關(guān)節(jié)強(qiáng)直而喪失勞動力。有學(xué)者研究表明外周血淋巴細(xì)胞比例失調(diào)見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性血小板減少性紫癜等自身免疫性疾病患者[1-3],并與疾病的發(fā)生密切相關(guān),但淋巴細(xì)胞亞群與AS關(guān)系的報道卻不多見。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對AS患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測分析,以探討淋巴細(xì)胞與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 2008年12月至2009年7月來我院就診的AS患者,參照1984年修訂的AS 36例診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],符合以下3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn):(1)腰痛持續(xù)3個月以上,活動后減輕,休息后無緩解;(2)腰椎額狀面和矢狀面活動受限;(3)腰廓活動度低于相應(yīng)年齡、性別的正常人(＜2.5 cm);放射學(xué)標(biāo)準(zhǔn)髂關(guān)節(jié)炎為雙側(cè)≥Ⅱ級或單側(cè)Ⅲ-Ⅳ級或僅符合放射學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。男25例,女11例,年齡15-32歲,平均年齡23.1±4.8歲。對照組32名,男性20例,女性 12例,平均年齡25.8±3.6歲,無自身免疫性疾病及骨關(guān)節(jié)病。

1.2 主要試劑及儀器 試劑美國BD公司生產(chǎn)的SimulSET IMK Plus試劑盒。其中包括CD45-FITC/CD14-PE,IgG1-FITC/IgG2a-PE,CD4-FITC/CD8-PE,CD3-FITC/CD19-PE,CD3-FITC/CD16+56-PE,CD3-FITC/HLA-DR-PE 6只熒光抗體;BD FACS紅細(xì)胞裂解液。用美國BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 方法 抽取待檢患者清晨空腹靜脈血2 ml,EDTA-K2抗凝。6個試管中分別加入上述6種熒光標(biāo)記抗體 20 μ l,每管 100 μ l全血 ,混勻 ,室溫避光靜置20分鐘,每管加入2 ml紅細(xì)胞裂解液,混勻后室溫避光反應(yīng)10分鐘,1 000 r/min離心10分鐘,棄上清,每管加2 ml PBS洗滌,以300 μ l PBS懸浮細(xì)胞。首先用BD公司的CaliBRITE三色標(biāo)準(zhǔn)微球,通過FACSComp軟件自動校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀,激發(fā)光波長為488 nm,然后打開SimulSET軟件,獲取細(xì)胞,并分別報告出淋巴細(xì)胞亞群百分比。

1.4 統(tǒng)計分析 以t檢驗(yàn)比較組間結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 AS患者及正常人外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例

患者組外周血中CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞與正常對照組外周血相比明顯降低(t=1.79,P＜0.05),CD4+/CD8+比值明顯升高(t=1.96,P＜0.05),CD3+、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞均有所升高,但無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

表1 AS患者T淋巴細(xì)胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

表1 AS患者T淋巴細(xì)胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

注:與對照組比較,*P＜0.05

組別 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+CD4+/CD8+AS組 66.9±9.0 36.4±5.5 39.0±9.0* 1.1±0.3*對照組 64.3±11.7 35.5±8.8 43.9±8.4 0.9±0.5

2.2 AS患者及正常人外周血B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及活化T淋巴細(xì)胞比例

CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞明顯升高(t=2.437,P＜0.05),CD3-CD16+56+NK細(xì)胞明顯降低(t=1.83,P＜0.05),CD3+HLA-DR+活化T淋巴細(xì)胞明顯降低(t=2.40,P＜0.05)。見表2。

表2 AS患者B,NK及活化T淋巴細(xì)胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

表2 AS患者B,NK及活化T淋巴細(xì)胞亞群百分率與正常對照組比較(±s,%)

注:與對照組比較,*P＜0.05

組別 CD3-CD19+ CD3-CD16+56+CD3+HLA-DR+AS組 11.8±4.3* 21.5±9.6* 15.7±7.3*對照組 8.9±3.1 27.8±11.8 22.4±10.0

3 討論

T淋巴細(xì)胞是一種重要的免疫活性細(xì)胞,根據(jù)T細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的不同將其分成不同T細(xì)胞亞群。CD3代表全部T淋巴細(xì)胞,CD4是T輔助(Th)的表面標(biāo)志,CD4+T細(xì)胞具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞以及活化巨噬細(xì)胞等功能,在輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫中發(fā)揮作用。CD8是抑制/殺傷 T細(xì)胞(Ts)的表面標(biāo)志,CD8+T細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)及抑制T細(xì)胞活化、抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、抑制細(xì)胞免疫及體液免疫的作用。機(jī)體的相對免疫平衡狀態(tài)主要由它們的相互影響來維持,兩亞群細(xì)胞比例的失調(diào)就會產(chǎn)生免疫功能失常,因此CD4+/CD8+比值代表了整體的免疫平衡[5]。本研究顯示,AS患者CD3+CD4+百分率升高,CD3+CD8+降低,CD4/CD8比例顯著升高,說明AS患者T細(xì)胞免疫失衡。AS患者的B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)與對照組比較有明顯增高,提示B淋巴細(xì)胞在AS的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用,與以往研究結(jié)果一致[6]。

NK細(xì)胞(CD3-CD16+56+)在抗病毒感染及抗變異細(xì)胞的早期起到?jīng)Q定作用,它們可通過釋放細(xì)胞因子如INF-γ來快速殺死異常細(xì)胞。同時,NK細(xì)胞在調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)中起重要作用,它主要通過釋放細(xì)胞因子對機(jī)體免疫功能加以調(diào)節(jié),可抑制B細(xì)胞的分化和增殖,同時對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能起調(diào)節(jié)作用[7]。已有學(xué)者研究表明系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病患者外周血中NK細(xì)胞減少、功能受損[8]。本文發(fā)現(xiàn)AS患者NK細(xì)胞數(shù)量與對照組相比明顯減少,提示具有調(diào)節(jié)功能的NK細(xì)胞選擇性減少,不能有效調(diào)控自身免疫反應(yīng),導(dǎo)致 B細(xì)胞產(chǎn)生過多免疫球蛋白,可能為其發(fā)病的主要原因之一。該結(jié)果與Niva Azuz-Lieberman等人的研究結(jié)果相反[9],可能由種族或研究方法差異所致。

HLA-DR是淋巴細(xì)胞晚期的活化標(biāo)志,AS患者CD3+HLA-DR+細(xì)胞明顯低于正常對照組,T細(xì)胞活化功能降低,致使抑制性T淋巴細(xì)胞不能發(fā)揮其抑制效應(yīng),從而導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞增加及活化,產(chǎn)生大量自身抗體,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

本文表明,T淋巴細(xì)胞亞群的改變和NK細(xì)胞活性降低,導(dǎo)致B細(xì)胞功能亢進(jìn),產(chǎn)生多種自身抗體,在AS的發(fā)病機(jī)理中可能起到重要的作用。淋巴細(xì)胞亞群的改變會導(dǎo)致哪些細(xì)胞因子的變化、采用哪類細(xì)胞因子拮抗劑來治療AS還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Li WX,Pan HF,Hu JL,et al.Assay of T-and NK-cell subsets and the expression of NKG2A andNKG2D in patients with new-onset systemic lupus erythematosus[J].Clin Rheumatol,2010,29(3):315.

[2]Semple JW,ProvanD,Garvey MB,et al.Recent progress in understanding the pathogenesis of immune thrombocytopenia[J].Curr Opin Hematol,2010,17(6):590.

[3]Friese MA,Fugger L.Pathogenic CD8(+)T cells in multiple sclerosis[J].Ann Neurol,2009,66(2):132.

[4]van der Linden S,Valkenburg HA,Cats A.Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis.A proposal for modification of the New York criteria[J].Arthritis Rheum,1984,27(4):361.

[5]Stockinger B,Bourgeois C,Kassiotis G.CD4+memory T cells:functional differentiation and homeostasis[J].Immunol Rev,2006,211(1):39.

[6]Lin Q,Gu JR,Li TW,et al.Value of the peripheral blood B-cells subsets in patients with ankylosing spondylitis[J].Chin Med J(Engl),2009,122(15):1784.

[7]馬 莉,顧 健,汪中強(qiáng),等.流式細(xì)胞術(shù)檢測SLE患者甲強(qiáng)龍沖擊前、后淋巴細(xì)胞亞群的變化[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2005,12(4):259.

[8]Park YW,Kee SJ,Cho YN,et al.Impaired differentiation and cytotoxicity of natural killer cells in systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,2009,60(6):1753.

[9]Niva Azuz-Lieberman,Gal Markel 1,Sa'ar Mizrahi 1,et al.The involvement of NK cells in ankylosing spondyliti[J].Int Immunol,2005,17(7):837.