多重PCR在沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染診斷中的應(yīng)用

李詠梅

(淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東淄博 255400）

現(xiàn)在全球最常見的公共衛(wèi)生問題中,食源性疾病排在首位,其主要原因是食品污染,主要病原菌有沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌[1]。因此,為了快速的、有效地檢測(cè)出病原菌,減少或預(yù)防食源性疾病的發(fā)生,臨床工作者和檢疫部門研究出效率更高的多重PCR檢測(cè)法。多重PCR檢測(cè)法是一種更優(yōu)于PCR的特殊技術(shù),在同一體系中可以加入多種引物,并對(duì)多個(gè)待檢基因進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)多種病原體也只需一次PCR反應(yīng),因此,在鑒別診斷混合感染時(shí)多重PCR技術(shù)具有更加方便、快捷、高效率的優(yōu)勢(shì)[2]。本文中,我們就多重PCR在沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染診斷中的應(yīng)用效果進(jìn)行觀察,并將結(jié)果總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

將2009年3月-2010年3月來我院進(jìn)行診治的100例感染患者中采集的的沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為研究對(duì)象,將其分作兩份。將所有菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,在37攝氏度環(huán)境中培養(yǎng)18 h,進(jìn)行3次轉(zhuǎn)接后備用。

1.2 方法

將培養(yǎng)好的備用菌,即沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各1 ml、以密度為10 cfu/ml同時(shí)分別加入制備好的培養(yǎng)液中,在37攝氏度環(huán)境中,150 r/min的速度進(jìn)行18 h的振蕩培養(yǎng)。選用平板計(jì)數(shù)法,將培養(yǎng)后的增菌液1ml以10倍梯度用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,用Baird—Parker平板和WS平板計(jì)數(shù)。多重 PCR檢驗(yàn)方法:取 1.0 ml增菌液,以14 000 r/min的速度離心5 min,在沉淀中加入1.0 mLTE清洗30 s,繼續(xù)離心5 min,當(dāng)超純水中溶解后,進(jìn)行15 min沸水浴,然后快速給予5 min冰浴,以12 000 r/min的速度離心,為時(shí)3 min,取上清10 μ l作為PCR反應(yīng)模板。將大腸桿菌 0.5 μ l、金黃色葡萄球菌 1.0 μ l和沙門菌 0.5l μ l及模板 10 μ l,補(bǔ)超純水至25 μ l。PCR循環(huán)參數(shù)為:達(dá) 94攝氏度預(yù)變性7 min,溫度為94攝氏度時(shí)變性30 s,55攝氏度時(shí)退火30 s,72攝氏度時(shí)延伸30s,共循環(huán)30次;最后在72攝氏度環(huán)境下延伸5 min。然后取PCR產(chǎn)物8 μ l與溴酚藍(lán)2 μ l混勻,在100V 電壓下用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳30 min,將其分別放置在凝膠成像系統(tǒng)中,分析結(jié)果。另一份進(jìn)行普通PCR檢測(cè)法。后將兩種檢測(cè)方法的檢出率、敏感性和特異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及比較。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)兩組細(xì)菌的檢出率、敏感性、特異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將文中統(tǒng)計(jì)及檢測(cè)所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS14.0進(jìn)行相關(guān)處理,計(jì)數(shù)資料進(jìn)行 χ2檢驗(yàn),P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

將兩組細(xì)菌的檢出率、敏感性和特異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、比較,結(jié)果見表1。

表1 兩組細(xì)菌的檢出率、敏感性和特異性比較(n=100）

由表1可見,多重PCR組的檢出率、敏感性和特異性均高于普通PCR組,P＜0.05,有顯著性差異。

3 討論

歷年來,我國(guó)對(duì)食源性疾病缺乏正確的認(rèn)識(shí),在此方面的研究也少之又少。因此,對(duì)于這種日常生活中比較常見的疾病原因和發(fā)病情況不甚了解。由于食品是否安全關(guān)系到消費(fèi)者的健康,食源性疾病成為食品安全的首要問題。為了更有效的控制和預(yù)防食源性疾病的發(fā)生,應(yīng)對(duì)容易被食源性致病菌污染的相關(guān)食品進(jìn)行多次認(rèn)真監(jiān)測(cè),盡量杜絕污染源,切斷污染環(huán)節(jié)。因此,食源性疾病不容忽視,還需檢測(cè)部門提供相關(guān)的檢測(cè)結(jié)果,根據(jù)該結(jié)果配合制定有效的公共衛(wèi)生條例[3]。由于食用不潔食物而引起的疾病在臨床上屢見不鮮,在我國(guó),污染食物的病原菌中,最常見的是沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。沙門菌可以導(dǎo)致敗血癥、傷寒及胃腸炎等疾病。食用被金黃色葡萄球菌污染的動(dòng)物性食品可引起食物中毒。大腸桿菌在自然界中幾乎隨處可見。而且臨床常出現(xiàn)這3種病原菌同時(shí)感染,因此,快速、有效地檢測(cè)出這些病原菌可以更好的控制疾病傳播[4]。目前檢測(cè)這些病原菌的方法是普通PCR檢測(cè)法。該技術(shù)的最大缺陷就是一次只能擴(kuò)增一個(gè)片段基因,如果感染的病菌不止一種時(shí),需要集中甚至幾十個(gè)PCR反應(yīng)。近年來,檢測(cè)部門開始應(yīng)用一種新的分子生物學(xué)技術(shù),該技術(shù)可以在一個(gè)PCR體系里進(jìn)行多種目的基因條帶的擴(kuò)增,可以節(jié)約時(shí)間和試劑的優(yōu)點(diǎn)[5]。該項(xiàng)技術(shù)克服了傳統(tǒng)PCR的固有缺陷,具有兼容性好、特異性強(qiáng)、敏感性高、高效性的優(yōu)點(diǎn)[6]。此外,呼吸道感染病菌也是臨床常見病癥,一般感染的病菌有細(xì)菌、病毒、衣原體及支原體等,使診斷和治療疾病出現(xiàn)不同程度的困難。而使用多重PCR技術(shù)保持了較高的敏感性和特異性,同時(shí)檢測(cè)多種致病菌,而且耗時(shí)短,給臨床醫(yī)師提供了相應(yīng)的參考,減少誤診現(xiàn)象,滿足了臨床對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的診治要求[7]。但需注意的是,由于多重PCR需在同時(shí)進(jìn)行幾條甚至幾十條引物的反應(yīng),如設(shè)計(jì)不合理,也有可能降低其反應(yīng)敏感度,使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)差錯(cuò),因此,該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件比較苛刻,臨床診斷疾病時(shí),還應(yīng)結(jié)合其他臨床資料及診斷方法。盡管如此,多重PCR技術(shù)在臨床診斷中仍具有重要的意義。由本文可見,多重PCR技術(shù)組在沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染的診斷中,其檢出率、特異性和敏感性均高于普通PCR技術(shù)組,因此我們認(rèn)為多重PCR技術(shù)組在沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染的診斷中應(yīng)用效果好,值得推廣應(yīng)用。

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[2]CAO Hong-yun,SHANG Chong-hua.Application of M ultiplex PCR on Detecting Animal Pathogen[J].Hubei Agricultural Sciences,2010,49(7）:1719.

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[4]許一平,成 煒,邵彥春,等.沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(6）:89.

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[7]曾凡勝,陸學(xué)東.多重PCR技術(shù)在呼吸系統(tǒng)感染疾病診斷中的應(yīng)用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,30(2）:147.