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    人前列腺癌細胞特異性結(jié)合短肽在人體組織的分布

    2011-08-20 10:40:26胡金秋張麗紅張國榮劉志晶董欣潔張玉輝李一雷
    中國實驗診斷學 2011年12期
    關(guān)鍵詞:前列腺癌

    胡金秋,李 偉,張麗紅,張國榮,劉志晶,董欣潔,張玉輝,李一雷

    (1.長春醫(yī)學高等專科學校病理教研室,吉林長春 130031;2.吉林大學病理生物學教育部重點實驗室,吉林長春 130021)

    前列腺癌(Carcinoma of Prostate,PC)是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,在歐美等西方國家僅次于肺癌是男性第二大癌癥[1],在我國的發(fā)病率位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。遠處轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者最主要的死亡原因。因此,從前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移方面作為切入點采用導向治療的方法著手研究前列腺癌的治療是未來人類戰(zhàn)勝前列腺癌的一個可能突破點。在前期研究中,利用噬菌體隨機七肽庫篩選得到一組與人前列腺癌細胞PC-3M特異性結(jié)合的前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)短肽[2-5],選取與共有序列最接近的特異性短肽,研究該結(jié)合短肽的配體蛋白在人體正常組織中的分布,為探索其在臨床抗前列腺癌導向治療中的應用提供形態(tài)學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 石蠟標本收集 收集2006年-2008年吉林大學白求恩醫(yī)學院尸檢及活檢標本:尸檢石蠟標本12例,組織塊53塊,包括臟器16種;前列腺組織活檢石蠟標本11例。

    1.1.2 主要試劑 PC-3M細胞來源于美國細胞庫(American Type Cuhure Collection,ATCC);抗M13小鼠單隆抗體購自瑞典Amersham公司,IMDM培養(yǎng)液購自GIBCO公司;SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶購自杰華科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 PC-3M細胞培養(yǎng)及爬片 將PC-3M細胞用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng),細胞生長至80%融合時以每孔2×104個細胞加入24孔板,每孔加500 μ l細胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)6小時后分別加入特異性結(jié)合短肽各1×1011pfu共培養(yǎng),分別以加入空載體和IMDM培養(yǎng)基作為陰性對照。24小時后,細胞融合達80%,4%多聚甲醛固定。

    1.2.2 擴增特異性結(jié)合短肽并測定滴度 用待擴增短肽感染大腸桿菌ER2738并擴增,用PEG/NaCl在4℃沉淀噬菌體。用10倍系列稀釋的噬菌體接種好ER2738的LB/IPTG/Xgal平板,檢查計數(shù)有-102個噬菌斑的平板上的噬菌斑數(shù),再用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10μ l噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。

    1.2.3 免疫組織化學方法進行檢測 特異性短肽是表達在M-13噬菌體表面的,所以選用抗M-13噬菌體抗體作為檢測短肽與細胞結(jié)合的抗體。用PC-3M細胞作為陽性對照,用PBS和空載體分別取代特異性短肽,用PBS取代抗M-13噬菌體抗體做陰性對照,對人體各組織標本進行免疫組織化學染色。前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物是人前列腺癌PC-3M細胞膜蛋白的結(jié)合物,所以該短肽與待檢測組織細胞的結(jié)合均以細胞膜上出現(xiàn)黃色顆粒為判定陽性的標準,基本不著色定為陰性(-),淡黃色定為弱陽性(+)、黃色定為陽性(++)、棕黃色定為強陽性(+++)。本文結(jié)果所統(tǒng)計的陽性率是以+-+++為陽性計算。

    2 結(jié)果

    2.1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在上皮組織的分布

    2.1.1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在腺上皮的分布 免疫組織化學半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在胰腺的內(nèi)分泌部即胰島有配體蛋白能與之結(jié)合,12例標本中陰性有6例,弱陽性為2例,陽性為4例,其陽性率為50%。在胃底腺壁細胞上有配體蛋白與短肽結(jié)合,10例標本中陰性為4例,表達為弱陽性有2例,陽性有4例,其陽性率為60%。在腎上腺等其他腺體中未見有配體蛋白與之結(jié)合(表1,圖1、2)。

    表1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在腺上皮的分布

    2.1.2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在被覆上皮的分布 免疫組織化學半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在各種被覆上皮中未見有配體蛋白與之結(jié)合(表2)。

    2.2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在結(jié)締組織和神經(jīng)組織的分布

    免疫組織化學半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在結(jié)締組織和神經(jīng)組織中未見有配體蛋白與之結(jié)合(表3)。

    2.3 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在肌組織的分布

    免疫組織化學半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在肌組織中未見有配體蛋白與之結(jié)合(表4)。

    圖1 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在胰腺上的分布

    圖2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在胃底腺上的分布

    表2 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在被覆上皮的分布

    表3 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在結(jié)締組織和神經(jīng)組織的分布

    表4 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在肌組織的分布

    2.4 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在前列腺增生的表達情況

    免疫組織化學半定量分析表明,前列腺癌侵襲相關(guān)蛋白結(jié)合物在前列腺增生時未見有配體蛋白與之結(jié)合(表5)。

    綜上結(jié)果顯示,檢測了人體腦、心、肝、腎、喉、氣管 、肺 、脾 、垂體 、腎上腺 、甲狀腺 、胸腺 、小腸 、胃 、胰腺、卵巢共16種器官,人前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的特異性結(jié)合短肽與被覆上皮、肌組織、神經(jīng)組織、結(jié)締組織無結(jié)合;與大多數(shù)腺上皮無結(jié)合;與人胃底腺壁細胞有親和性,配體蛋白表達的陽性率為60%;與胰島細胞有親和性,配體蛋白表達的陽性率為50%;在良性前列腺增生時無表達。

    表5 前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白結(jié)合物的配體蛋白在前列腺增生的結(jié)合情況

    3 討論

    前列腺癌已經(jīng)成為男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。雖然目前對前列腺癌有多種治療手段,如內(nèi)分泌治療、放療、化療和手術(shù)治療。但無論哪種治療方法對于發(fā)生了雄激素抵抗的患者都不能達到理想的治療要求[6],因而探討前列腺癌的治療方法是臨床上迫切需要的。

    前列腺癌蛋白質(zhì)組學在國際上正在進行,如前列腺腫瘤標記物的尋找、前列腺癌的診斷、干預機制的研究等[7-9],努力尋找能夠特異性殺傷腫瘤細胞的抗腫瘤藥物是許多致力于腫瘤研究的學者所研究的熱點項目[10]。抗腫瘤導向治療的問世更需要高效特異性載體,以實現(xiàn)抗腫瘤治療的高效能性和低損傷性。

    結(jié)合前期進行的前列腺癌特異性結(jié)合短肽方面系列研究[2-5],本實驗觀察序列為CGWTPVI的特異性結(jié)合短肽的配體蛋白在人體正常組織中的分布情況,從而為該短肽在抗前列腺癌導向治療中的應用提供形態(tài)學依據(jù)。掌握該短肽的配體蛋白在人體組織器官中的分布情況將使短肽有可能成為導向治療的更高效載體,使藥物在前列腺癌局部達到高濃度發(fā)揮作用,而不與人體正常組織細胞結(jié)合從而減少藥物的副作用。本實驗還同時檢測該配體蛋白在前列腺增生時的表達情況,目的在于觀察在前列腺良性病變和惡性病變時蛋白表達的差異,以便進一步分析此種蛋白表達差異對細胞生物學行為的影響,探討腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機制。

    進而,在前期系列研究基礎(chǔ)上,還可以通過釣取人前列腺癌PC-3M細胞膜上與特異性短肽相結(jié)合的配體,對其詳細信息和功能進行分析,進一步研究蛋白質(zhì)間相互作用。或者進一步檢測該特異性短肽在各型前列腺癌和其它腫瘤細胞上是否有配體蛋白,探討該短肽是特異性存在于高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞,還是多種高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞所共有,從而有可能發(fā)現(xiàn)一種全新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。進一步探討與前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路,為研究前列腺癌或者其他腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機制提供線索。

    總之,本實驗檢測了前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)結(jié)合短肽的配體蛋白在人體組織、器官中的分布情況,并檢測了短肽在前列腺增生時配體蛋白表達情況,掌握了短肽的特異性,這為進一步研究前列腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制提供了研究線索,為該短肽在前列腺癌的抗腫瘤導向治療中的應用提供形態(tài)學依據(jù)。該短肽可與前列腺癌細胞表面特異性蛋白結(jié)合,而與大部分人體正常組織無結(jié)合,具有良好的特異性,證明該短肽具有臨床應用的潛能,為針對前列腺癌的抗腫瘤導向治療中藥物載體的設計提供了基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

    [1]Kurahashi N,Sasazuki S,Iwasaki M,Inoue M,Tsugane S.Green tea consumption and prostate cancer risk in Japanese men:A prospective study[J].American Journal of Epidemiology,167(1),2008.71.

    [2]李 群,李一雷,張 越,等.人前列腺癌PC-3M細胞中與轉(zhuǎn)移相關(guān)靶標蛋白的篩選[J].中國老年學雜志,2008,28(1):124.

    [3]李 群,李一雷,牛 云,等.人前列腺癌PC-3細胞膜蛋白組學的分析[J].中國生物制品學雜志,2008,21(1):33.

    [4]李 群,李一雷,李貴榮,等.轉(zhuǎn)移潛能不同的人前列腺癌細胞系差異膜蛋白質(zhì)組學的分析[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(2):118.

    [5]夏 陽,李一雷,李 群,等.人前列腺癌細胞特異性結(jié)合短肽的篩選[J].中國實驗診斷學,2007,11(2):143.

    [6]Pfitzenmaier J,Altwein JE.Hormonal therapy in the elderly prostate cancer patient[J].Dtsch Arztebl Int,2009,106(14):242.

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    [9]Goo YA,Young Ah,Li Z,et al.Systematic investigation of lycopene effects in LNCaP cells by use of novel large-scale proteomic analysis software,Pro Clin Appl,2007,1(5):513-523.

    [10]金光虎,陳 爽,楊 麗,等.羥基喜樹堿對人前列腺癌PC-3m細胞凋亡的影響[J].中國實驗診斷學,2010,1:12.

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