卵巢惡性腫瘤標(biāo)志物-CA125微柱凝膠免疫檢測方法的建立及評價(jià)

方紅娟,蔡智天,鐘 磊,潘 穎,宋 波,杜 博

(1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 電診科,吉林 長春 130011;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心,吉林 長春130021;

3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科,吉林 長春130033;

4.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林 長春130033;5.吉林省腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,吉林 長春 130012）

卵巢惡性腫瘤(Ovarian malignant tumor）是危害婦女生命和健康的主要疾病,而在卵巢惡性腫瘤的病理類型中,卵巢上皮性惡性腫瘤最多,死亡率亦最高,如果對卵巢惡性腫瘤能夠做出早期診斷,可使患者的長期生存率得到顯著提高。有研究表明,卵巢上皮性惡性腫瘤的血清特異性標(biāo)志物為CA125[1]。

微柱凝膠技術(shù),是近年來在國外很多先進(jìn)血液免疫實(shí)驗(yàn)室得到大力推廣的一種新的檢測技術(shù),作為一種新型定性的檢測方法,它具有較高的檢測靈敏度[2,3],已在臨床應(yīng)用于多項(xiàng)疾病的早期篩查和診斷[4]。

目前臨床多采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測患者血清CA125的表達(dá)作為早期篩查卵巢惡性腫瘤的方法,與該方法相比,微柱凝膠技術(shù)具有操作簡單、省時(shí)、敏感性高、結(jié)果易保存等優(yōu)點(diǎn)[5,6],有很大開發(fā)利用價(jià)值。微柱凝膠技術(shù)用于卵巢惡性腫瘤標(biāo)志物CA125的檢測,目前國內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究應(yīng)用微柱凝膠的檢測原理,根據(jù)患者病理診斷選取265例正常婦女及232例卵巢上皮性惡性腫瘤患者作為研究對象,檢測血清中CA125的表達(dá)情況,并與化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測結(jié)果進(jìn)行對比,探討微柱凝膠法檢測卵巢惡性腫瘤標(biāo)志物CA125對卵巢惡性腫瘤的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院、長春市婦產(chǎn)科醫(yī)院和吉林省腫瘤醫(yī)院2007年4月至2009年1月間婦科住院患者血清標(biāo)本,均有完整的臨床資料?；颊吣挲g在15-77歲之間,平均年齡46歲。

1.2 標(biāo)本收集及處理抽取靜脈血約3 ml,離心機(jī)12 000 r/min分離血清,取上清液置-20℃保存。

1.3 入選病例的觀察及分組卵巢上皮性癌(Ⅰ-Ⅱ期）及卵巢上皮性癌(Ⅲ-Ⅳ期）232例,所有卵巢惡性腫瘤患者均未合并其他惡性腫瘤,正常婦女血清265例。分別應(yīng)用微柱凝膠法及目前臨床應(yīng)用的化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清中CA125的量。所有研究對象均有病理診斷。

1.4 主要試劑及實(shí)驗(yàn)方法兔抗CA125IgG(生物素標(biāo)記）、羊抗兔IgG、親和素購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;微柱凝膠免疫分析技術(shù)專用離心機(jī)和孵育器由長春博研醫(yī)學(xué)生物儀器公司生產(chǎn);MGCoombs'試劑卡由長春博訊生物技術(shù)有限公司提供。儀器:離心機(jī)(德國生產(chǎn)）,振蕩器(水浴恒溫）(江蘇金壇市金成國勝試驗(yàn)儀器廠）?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑由CH IRON公司提供,液相試劑為標(biāo)記吖啶酯的M 11單克隆抗體。固相試劑為包被在磁粉顆粒上的OC125單克隆抗體。儀器為美國CH IRON公司生產(chǎn)的ACS:180全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。實(shí)驗(yàn)方法:包括指示細(xì)胞的制備,微柱凝膠的制備。將兔抗CA125抗體稀釋倍數(shù)為1∶200,指示紅細(xì)胞稀釋100倍,50 μ l待檢血清加入微柱凝膠卡中,將50 μ l稀釋的兔抗CA125抗體加入微柱凝膠卡中,置37℃恒溫孵育器中30 min,將稀釋好的指示紅細(xì)胞50 μ l加入卡里,孵育 15 min,后置離心機(jī)離心 15 min?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法采用雙抗體夾心法,分析過程采用自動(dòng)化,儀器自動(dòng)吸樣品50 μ l,液相試劑250 μ l,固相試劑 250 μ l,37 ℃溫浴 7.5 min,沖洗后,自動(dòng)加入反應(yīng)試劑(堿性雙氧水）,激發(fā)反應(yīng),其發(fā)光強(qiáng)度與樣品濃度呈正比。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)觀察的陽性結(jié)果以肉眼見紅細(xì)胞被扣留在凝膠之間為陽性,紅細(xì)胞沉淀在管底為陰性[7],+為1/4紅細(xì)胞少部分被扣留在凝膠之間,2+為1/2紅細(xì)胞被扣留在凝膠之間,3+為3/4紅細(xì)胞被扣留在凝膠之間,4+為肉眼見紅細(xì)胞全部被扣留在凝膠之間;化學(xué)發(fā)光免疫分析法按藥盒上的建議＞35 U/mL為陽性值。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以病理診斷作為金標(biāo)準(zhǔn),微柱凝膠法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測卵巢上皮性惡性腫瘤血清CA125的結(jié)果,計(jì)算兩種檢測方法的靈敏度和特異度分別為 84.6%,88.6%和88.4%、91.3%。(見表1和表2）

表1 微柱凝膠免疫檢測法檢測血清CA1254的結(jié)果

表2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清CA125結(jié)果

3 討論

卵巢腫瘤標(biāo)志物對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測,甚至靶向性治療具有重要意義。卵巢癌腫瘤標(biāo)志物研究較多的是血清CA125,血清CA125水平的確與卵巢癌的惡性程度有關(guān),在絕經(jīng)后婦女中證實(shí)有篩查卵巢癌的價(jià)值。血清卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物的檢測方法有多種,如ELISA方法[8],化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定,放射免疫技術(shù),質(zhì)譜技術(shù),基因和蛋白質(zhì)組學(xué)[9,10]等,目前臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物檢測方法為化學(xué)發(fā)光免疫分析法,是目前各種免疫分析中最有前途的方法之一,但此項(xiàng)檢測儀器價(jià)格昂貴,不適于在社區(qū)或經(jīng)濟(jì)效益小的中小醫(yī)院開展,亦不適于作為早期卵巢癌篩查的首選。Y.Lapierre[11]介紹了一項(xiàng)免疫學(xué)檢測新技術(shù)即微柱凝膠免疫實(shí)驗(yàn)。該技術(shù)的本質(zhì)是血凝試驗(yàn),即紅細(xì)胞抗原抗體在微柱腔內(nèi)的凝膠介質(zhì)中發(fā)生肉眼可見的免疫凝集反應(yīng)。它的特點(diǎn)為:簡單、可標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化、重復(fù)性好,一卡六管,減少標(biāo)記,避免錯(cuò)誤,所需標(biāo)本量少、無須洗滌、結(jié)果穩(wěn)定、易于判讀。目前傾向于多種血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測[12],以提高診斷的敏感度和特異度。但因本實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)有限,本文只進(jìn)行了卵巢惡性腫瘤標(biāo)志物CA125的檢測,未進(jìn)行多種腫瘤標(biāo)志物的檢測,此部分將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。利用其優(yōu)點(diǎn),本研究應(yīng)用微柱凝膠的原理,檢測卵巢惡性腫瘤標(biāo)志物CA125的水平并與化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行比較。

本研究顯示,微柱凝膠檢測方法檢測靈敏度、特異度更接近化學(xué)發(fā)光分析方法的檢測靈敏度及特異度。

我們可以利用微柱凝膠檢測方法簡便、快捷、以及成本低的特點(diǎn),可在一些經(jīng)濟(jì)及技術(shù)比較落后的縣級及鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生醫(yī)院替代目前臨床常用的化學(xué)發(fā)光免疫分析法,作為卵巢惡性腫瘤早篩查、早診斷及治療后的跟蹤隨訪一線檢測方法。為其在臨床上腫瘤標(biāo)志物的檢測提供了更廣闊的發(fā)展空間。

[1]郁琦綜述.連利娟審校.CA125與卵巢上皮癌[J].國外醫(yī)學(xué)?婦產(chǎn)科學(xué)分冊,1991,18(1）:12.

[2]Novaretti MC,Jens E,Pagliarini T,et al.Comparison of conve-ntional tube test with diamed gel microcolumn assay for anti-D titration[J].Clin Lab Haematol,2003,25:311.

[3]Kimura S,Yurugi K,Segawa H,et al.Rapid quantitation of immunog-lobulin G antibodiesspecific for blood group antigens A and B by surface plasmon resonance[J].Transfusion,2005,45:56.

[4]李 勇,馬學(xué)嚴(yán).實(shí)用免疫血液學(xué)[M].第2版,西安:陜西科學(xué)出版社,2006.562-570.

[5]周金安,魏 晴,涂同濤,等.微柱凝膠卡及試管法對抗D效價(jià)檢測的比較[J].中國輸血雜志,2008,21(3）:197.

[6]渾守永,劉明霞,王玉芝.微柱凝膠技術(shù)在不規(guī)則抗體篩選中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,21(1）:38.

[7]王小平.微柱凝膠法應(yīng)用于血型鑒定[J].廣州醫(yī)藥,2007,38(2）:61.

[8]Shafat I,Zcharia E,Nisman B,NadirY,Nakhoul F,Vlodavsky I,et al.An ELISA method for the detection and quantification of human heparanase[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,341:958.

[9]Hibbs K,Skubitz KM,Pambuccian SE,et al.Differential gene expression in ovarian carcinoma:identifi cation of potential biomarkers[J].Am J Pathol,2004,165:397.

[10]Israeli O,Gotlieb WH,Friedman E,et al.Genomic analyses ofprimary andmetastatic serous epithelial ovarian cancer[J].Cancer Genet Cytogenet,2004,154:16.

[11]Lapierre Y,Rigal D,Adam J.The gel test:A new way to detect red cell antigen antibody reactions,1990.

[12]Murray-Zmijewski F,Lane DP,Bourdon JC.p53/p63/p73 isoforms:an orchestra of isoforms to harmonise cell differentiation and response to stress[J].Cell Death Differ,2006,13:962.