qRT-PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原編碼基因表達(dá)水平

陳 偉,王遠(yuǎn)志,李永祥,米利古,張 輝,張 娟,魏克娜,袁 俐

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,新疆石河子 832002;2.婁底市中心醫(yī)院輸血科,湖南婁底 417100）

結(jié)核病是人類致死的主要感染性疾病之一,全世界有1/3的人感染過結(jié)核分枝桿菌,且以每年有900萬新發(fā)病例的速度發(fā)展[1]。隨著耐藥和耐多藥結(jié)核的不斷出現(xiàn),導(dǎo)致傳統(tǒng)的以異煙肼為一線治療藥物的化療方案失效,使結(jié)核病成為當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題,因此對(duì)耐藥結(jié)核病的早期診斷和早期治療是控制耐藥結(jié)核病的至關(guān)重要的[2]。

結(jié)核分枝桿菌無內(nèi)毒素也不產(chǎn)外毒素和侵襲性酶,其致病性可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥、菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性及機(jī)體對(duì)菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān),而結(jié)核分枝桿菌分泌的蛋白及菌體蛋白在宿主抗結(jié)核分枝桿菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。結(jié)核分枝桿菌mRNA的半衰期很短(約3-5 mim）,是結(jié)核分枝桿菌活菌診斷及檢測(cè)藥物敏感性很好的分子標(biāo)志[3]。本試驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄水平來探討結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原編碼基因的表達(dá)水平在耐藥菌株和敏感株及北京基因型和非北京基因型中的差異以及qRT-PCR診斷活菌的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所提供,46株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(本實(shí)驗(yàn)室保存菌種）,其中耐藥組22株,敏感組24株,北京基因型組26株,非北京基因型組20株,以及2株非結(jié)核分枝桿菌。藥物敏感試驗(yàn)采用絕對(duì)濃度法,結(jié)果判定以在濃度高于1 μ g/ml的異煙肼培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為異煙肼耐藥[4],北京基因型分型采用RD105缺失基因檢測(cè)法進(jìn)行分型[5]。

1.1.2 主要試劑與儀器 細(xì)菌RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海東洋紡生物科技有限公司,PMD18-T載體、熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連）公司,Smart CyclerⅡ?qū)崟r(shí)定量PCR儀購自Cepheid公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 通過primer3.0在線軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物(表1）。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 取7H9液體培養(yǎng)基(含OADC）中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)菌1-3 ml,按Omega公司的細(xì)菌RNA提取試劑盒操作步驟提取RNA,1.2%變性瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性。取1 μ l RNA于65℃變性5 min,立即置于冰上,按逆轉(zhuǎn)錄體系 :primer mix 0.5 μ l、逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ l 、Buffer 2.0 μ l、RNA 1.0 μ l、H2O(無Rnase）6.0 μ l。37℃15min,98℃5 min,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,-20℃保存。

1.2.2 Siga、fbpB、psts1及mpt64定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以 cDNA為模板,擴(kuò)增 Siga、fbpB、psts1及mpt64的基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,用膠回收試劑盒回收后,與pMD18-T simple載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5а,涂布于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落,菌落PCR進(jìn)行初步鑒定,陽性克隆送測(cè)序分析(由上海生物工程公司完成）。從測(cè)序正確的陽性菌株中抽提質(zhì)粒,-20℃保存。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)Siga、fbpB、psts1 及mpt64 mRNA表達(dá)水平 將含siga、fbpB、psts1及mpt64基因的質(zhì)粒,準(zhǔn)確定量后倍比稀釋(10×）,分別制備成107、106、105、104、103、102、101copies/μ L 的標(biāo)準(zhǔn)品,以稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及陰性對(duì)照分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系(共 25 μ l）:SYBR Premix(2 ×）12.5 μ l,上 、下游引物各 0.5 μ l,模板 2.0 μ l,H2O 9.5 μ l。 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃15 s,62℃30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán),Smart CyclerⅡ?qū)崟r(shí)定量PCR儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及融解曲線。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 將所測(cè)得樣品的Ct平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出內(nèi)參基因和目的基因的表達(dá)量。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后得出相對(duì)表達(dá)量(相對(duì)表達(dá)量=實(shí)際表達(dá)量/內(nèi)參基因表達(dá)量）,運(yùn)用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 Siga、fbpB、psts1及 mpt64標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

Siga的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-0.358x+11.618,曲線的斜率為-0.358,相關(guān)系數(shù)為1.000,擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線有一個(gè)主峰值,無非特異性擴(kuò)增及引物二聚體產(chǎn)生。

2.2 樣品檢測(cè)結(jié)果

fbpB、psts1及mpt64基因在敏感菌株、耐藥菌株、北京基因型、非北京基因型及H37Rv中的表達(dá)水平(詳見表2）。由表中結(jié)果得出結(jié)核分枝桿菌psts1基因在北京基因型菌株中的表達(dá)低于標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv及非北京基因型菌株,mpt64基因在耐藥菌株中的表達(dá)低于標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv及敏感菌株。

表2 結(jié)核分枝桿菌 fbpB、psts1及 mpt64基因的表達(dá)水平

3 討論

qRT-PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量。實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。已被廣泛地應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的鑒定以及耐藥性的檢測(cè)上[6,7]。孟茹等以CFP-10基因建立的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度高,檢測(cè)下限達(dá)1×101copies/μ L,比常規(guī)PCR敏感性高出100倍[8]。PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的研究當(dāng)中,由于在接受標(biāo)準(zhǔn)有效化療的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本,培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后180天仍有25%的標(biāo)本DNA檢測(cè)陽性[3],所以檢測(cè)到DNA分子不能判斷細(xì)菌的死與活,而mRNA定量體外擴(kuò)增法主則可以快速判斷是否為活菌,用于化療效果的監(jiān)測(cè)具有早期快速評(píng)價(jià)的功能,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)判斷治療是否有效以及是否需要及時(shí)調(diào)整治療方案。因此,以結(jié)核分枝桿菌mRNA分子為靶點(diǎn)的活菌檢測(cè)是較DNA診斷更先進(jìn)一步、不可替代的方法,特別是對(duì)結(jié)核分枝桿菌這類體外培養(yǎng)生長(zhǎng)十分緩慢的病原菌的診斷更具有獨(dú)特的意義。

由psts1基因編碼的38kDa蛋白是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(屬于結(jié)核菌的膜蛋白）,與結(jié)核桿菌磷酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)。該蛋白含有特異的供B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原表位,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫。本試驗(yàn)中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)psts1基因表達(dá)量在北京基因型菌株中相比非北京基因型菌株及H37Rv是下調(diào)的,這與Pheiffer等[9]的報(bào)道一致,Pheiffer等比較了北京基因型菌株和標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的蛋白差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)和H37Rv相比,北京基因型菌株P(guān)stS1(38kDa蛋白）蛋白表達(dá)明顯減少。北京基因型菌株具有活躍的傳播能力,易獲得耐藥性是北京基因型分布流行廣泛的內(nèi)在原因之一。北京基因型菌株同耐藥性具有相關(guān)性[10]。因此可以推測(cè)北京基因型菌株是一組起先有相同祖先的菌株進(jìn)化而來,并在進(jìn)化過程中部分蛋白抗原編碼基因表達(dá)下調(diào),引起宿主非保護(hù)性免疫及抑制和逃逸宿主免疫,從而獲得耐藥性。

由mpt64編碼的MPT64蛋白是結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)物濾過蛋白的主要成分之一,只存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中,可被大多數(shù)結(jié)核病人和結(jié)核感染者的免疫系統(tǒng)所識(shí)別[11]。Roche等[12]通過測(cè)定MPT64蛋白的人T淋巴細(xì)胞表位,發(fā)現(xiàn)其抗原表位主要在124-143氨基酸殘基區(qū)域,小鼠和豚鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPT64具有很高的抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫保護(hù)力。在本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)mpt64編碼基因在耐藥菌株中的表達(dá)水平顯著低于敏感株及標(biāo)準(zhǔn)株,從而引起宿主對(duì)感染的結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答不強(qiáng)烈,可能是導(dǎo)致臨床上感染耐藥菌株的結(jié)核病表現(xiàn)出毒力、致病力以及傳染力下降且潛伏期延長(zhǎng)的原因之一。

從基因表達(dá)的mRNA水平到最終合成的蛋白質(zhì)水平,這其中包含著蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控、糖基化、磷酸化等諸多因素的影響,這些因素都有可能改變作為直接作用因子的蛋白質(zhì)的功能?；虻霓D(zhuǎn)錄水平是基因表達(dá)過程中最重要的第一個(gè)具有高度選擇性的環(huán)節(jié),轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能上也是十分關(guān)鍵的。因此從蛋白水平及宿主方面來研究耐藥結(jié)核同樣具有重要意義。

[1]FloydK,Pantoja A.Financial resources required for tuberculosis control to achieve global targets set for 2015[J].Bull World Health Organ,2008,86(7）:568.

[2]第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查——結(jié)核分支桿菌耐藥性分析與評(píng)價(jià)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(1）:3.

[3]陸 宇,朱莉貞,初乃惠,等.mRNA定量法用于結(jié)核分枝桿菌利福平敏感性分析的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(8）:549.

[4]曹紅艷,吳長(zhǎng)東,米利古,等.結(jié)核分枝桿菌新疆臨床分離株耐藥情況調(diào)查[J].中國病原生物學(xué)雜志,2010,5(4）:253.

[5]吳長(zhǎng)東,溫 澍,米利古,等.結(jié)核分枝桿菌新疆臨床分離株“北京家族”菌株的鑒定[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33(5）:372.

[6]Inoue M,Tang WY,Wee SY,et al.Audit and improve!Evaluation of a real-time probe-based PCR assay with internal control for the direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2011,30(1）:131.

[7]Ramirez MV,Cowart KC,Campbell PJ,et al.Rapid detection of Multidrug Resistant Tuberculosis usi ng real-time PCR and High Resolution Melt analysis[J].J ClinMicrobiol,2010,48(11）:4003.

[8]孟 茹,陳創(chuàng)夫,張 輝,等.結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(10）:1.

[9]Pheiffer C,Betts JC,Flynn HR,et al.Protein expression by a Beijing strain differs from that of another clinical isolate and Mycobacterium tuberculosis H37Rv[J].Microbiology,2005,151(4）:1139.

[10]Garcia de Viedma D,Chaves F.New Route of importation of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype[J].Emerg Infect Dis,2006,12(1）:169.

[11]劉麗蓉,樂 軍,王洪海,等.利用雙向電泳技術(shù)研究異煙肼耐藥MTB感染U937引致的差異表達(dá)蛋白[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2006,2(2）:142.

[12]Roche PW,Winter N,Triccas JA,et al.Expression of Mycobacerium tuberculosis MPT64 in recombinant Mycosmegmatis:purification,immunogenicity and application to skin tests for tuberculosis[J].Clin Exp Immunol,1996,103(2）:226.在