QuEChERS萃取-液相色譜法測定醬油和醬制品中三氯蔗糖

宋佳,李錦清,李聰,周勇,黃翠莉,綦艷

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(廣東),廣東 佛山，528300)

三氯蔗糖極易溶于水，具有甜味純正，化學(xué)穩(wěn)定性好，高溫下甜味不變，甜度穩(wěn)定，無毒副作用等優(yōu)點[1-2]，廣泛應(yīng)用于醬油、飲料、乳制品、飲料酒[3-4]和果醬等加工食品中，在國內(nèi)外允許使用的各種甜味劑中，三氯蔗糖是特征性優(yōu)點最多的一種。我國GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對醬油和醬制品中三氯蔗糖的允許添加量進(jìn)行了規(guī)定，規(guī)定其最大使用量不得超過0.25 g/kg[5]。

目前食品中三氯蔗糖檢測標(biāo)準(zhǔn)有國家強制性標(biāo)準(zhǔn)GB 22255—2014[6]和地方標(biāo)準(zhǔn)DBS52/ 007—2014[7]。GB 22255—2014標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定含有蛋白脂肪樣品、醬及及醬制品、醋、醬油、飲料等樣品采用填料為N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯親水親脂平衡型填料的固相萃取柱進(jìn)行凈化、富集，含酒精的試樣采用蒸干后用乙腈水溶液溶解的前處理方法。DBS52/ 007—2014標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定白酒樣品采用水稀釋后直接檢測的前處理方法。另外，國內(nèi)文獻(xiàn)報道的食品中三氯蔗糖提取方法有甲醇、乙醇或乙腈萃取法[8-10]、固相萃取法[11-12]、直接稀釋法[13-14]、沉淀蛋白后直接測定法[15-18]等，其中以固相萃取法為主，使用的固相萃取柱有HLB柱[19]、中性氧化鋁柱[20]、C18固相萃取柱[21]等。由于醬油、醬制品等含有大量色素，上述的前處理方法去除色素效果并不明顯，其中HLB柱、C18柱、中性氧化鋁柱萃取時三氯蔗糖和大部分色素均被保留在固相萃取柱上，并隨洗脫液一起洗脫，未能達(dá)到去除色素，凈化樣品的目的。直接稀釋法、甲醇或乙腈萃取法、沉淀蛋白后直接測定法去除效果更差，僅適用于色素含量低或不含色素的樣品。大量存在的色素在檢測過程中容易損壞色譜柱，污染檢測器，甚至可能影響定性和定量，因此有必要建立一種回收率高、凈化效果好的前處理方法。

QuEChERS法是一種廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速前處理技術(shù)，對樣品中的色素去除效果明顯。目前，尚未有應(yīng)用QuEChERS法作為醬油、醬制品中三氯蔗糖的前處理方法的研究報道，本研究將QuEChERS方法進(jìn)行了改進(jìn)，用于萃取醬油和醬制品中三氯蔗糖，建立的前處理方法具有簡單、快速、回收率高、凈化效果好、成本低等優(yōu)點，適用于大批量樣品的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司；乙腈(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，美國TEDIA(天地)公司；NaCl、無水MgSO4(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品約15 mg(精確至0.1 mg)， 置于10 mL容量瓶中，加入超純水，輕輕搖勻，再用超純水定容至10 mL，搖勻，配得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液為1 500 μg/mL。取適量體積三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用超純水逐級稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，配制質(zhì)量濃度為20～1 500 μg/mL。

1.3 儀器與設(shè)備

LC-20A島津高效液相色譜儀(配置ELSD-LT Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測器)，日本島津公司；Sigma 3-18K高速冷凍離心機，美國Sigma公司；IKA渦旋混合器，德國IKA公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器，美國Millipore公司；DT-502A電子天平，常熟市金羊砝碼儀器有限公司。

1.4 液相色譜條件

流動相為：V(乙腈)∶V(水)=14∶86，等度洗脫方式；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)； 流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL； 蒸發(fā)光檢測器溶劑蒸發(fā)溫度為40～60 ℃，霧化氣體為氮氣，氮氣氣體壓力為350～420 kPa。在本方法條件下，三氯蔗糖保留時間為12.15 min。

1.5 前處理步驟

稱取均勻醬油或醬制品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL塑料離心管中，加入5 mL超純水，搖勻，加入20 mL乙腈，渦旋1 min，依次加入NaCl 5 g、無水MgSO42 g，立即劇烈渦旋1 min，使樣品變稠狀，9 000 r/min 離心2 min，將上層清液(乙腈層)轉(zhuǎn)移至125 mL 雞心瓶中。離心管中的樣品再用20 mL乙腈重復(fù)萃取1次，渦旋1 min，9 000 r/min離心2 min，乙腈層合并于雞心瓶中，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1.0 mL 超純水溶解，渦旋30 s，加入1.0 mL正己烷脫脂，渦旋，靜止分層，取下層水相過0.45 μm水系膜置于進(jìn)樣瓶中，用液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的選擇

目前文獻(xiàn)報道的前處理方法有甲醇或乙腈萃取法[22]、固相萃取法、直接稀釋法、沉淀蛋白后直接測定法等，其中以固相萃取法為主[23-24]。由于醬油或醬制品含有較多油脂和大量的色素，上述的這些前處理方法對色素等雜質(zhì)的去除效果較差，其中甲醇或乙腈萃取法、直接稀釋法、沉淀蛋白后直接測定法均不能去除醬油樣品中的黑色素。固相萃取法有HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、中性氧化鋁柱凈化法，這些固相萃取柱能將大部分色素和目標(biāo)物同時保留，同時被洗脫液洗脫，未能達(dá)到去除色素的目的，大量共存的色素在檢測過程中容易損壞色譜柱，污染檢測器，甚至可能影響定性和定量。

QuEChERS法是水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速前處理技術(shù)，對蔬菜中的色素凈化效果明顯。QuEChERS法包括萃取過程和凈化過程，萃取過程使用的試劑一般為乙腈、乙酸鈉、無水MgSO4等，目的是去除色素等雜質(zhì)初步凈化樣品。凈化過程使用PSA粉(乙二胺-N-丙基硅烷)、C18粉末或兩者混合，目的是進(jìn)一步凈化樣品，適用于對樣品凈化要求較高的質(zhì)譜檢測。PSA粉、C18粉末價格較貴，大批量樣品檢測時使用量較大，檢測成本高。

本研究將QuEChERS方法進(jìn)行了改進(jìn)，以乙腈作為萃取溶劑，NaCl和無水MgSO4作為輔助萃取劑，不經(jīng)過PSA粉或C18粉末的凈化步驟，大大降低檢測成本，同時也獲得較好的回收率和凈化效果。

試驗比較了不加NaCl和無水MgSO4的情況下，樣品直接用乙腈萃取，結(jié)果表明回收率僅有50%左右，原因是部分三氯蔗糖未被乙腈萃取，保留在水中。當(dāng)僅加入NaCl時，由于乙腈層含有少量水，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時容易暴沸，導(dǎo)致含量損失。樣品中加入NaCl和無水MgSO4，樣品中加入的NaCl，起到鹽析和降低乙腈和三氯蔗糖在水中的溶解度的作用。無水MgSO4去除乙腈中水分，與NaCl鹽析作用相配合，使乙腈對三氯蔗糖的萃取回收率達(dá)到80%以上。則可去除乙腈中的水分，避免暴沸的同時提高了回收率和凈化效果。對比使用C18固相萃取柱法、HLB固相萃取柱法、中性氧化鋁柱法提取三氯蔗糖的效果。劉芳等[21]使用C18固相萃取柱法提取不同狀態(tài)食品中的三氯蔗糖，樣品平均回收率為85.6%～108.2%；在HLB固相萃取柱法方面，趙貞等[19]在乳制品中所得回收率為94.6%～101.3%。此外，張偉清等[25]使用中性氧化鋁柱在醬油及醬制品測定三氯蔗糖回收率為85.2%～108.8%。由于醬油或醬制品含有大量的色素與雜質(zhì)，張偉清等[25]研究發(fā)現(xiàn)以3 000 r/min處理后所得試液仍難以通過中性氧化鋁柱，故使用固相萃取柱對樣品處理要求高，且除色素效果不佳。而QuEChERS在去除色素效果顯著，操作簡單，回收率也可達(dá)83.2%～95.4%，與固相萃取法相當(dāng)。

2.2 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的檢測條件下，采用不含三氯蔗糖的醬油和醬制品樣品添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方式考察本方法的檢出限。結(jié)果表明，醬油和醬制品樣品中三氯蔗糖的方法檢出限(LOD)為1 mg/kg，定量限(LOQ)為3 mg/kg，低于GB 22255—2014標(biāo)準(zhǔn)的檢出限(2.5 mg/kg)和定量限(7.5 mg/kg)。本方法三氯蔗糖的指數(shù)擬合線性范圍為20～1 500 μg/mL，指數(shù)擬合線性方程為Y=0.745X×e-3.826，相關(guān)系數(shù)為r2=0.998。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度

采用不含三氯蔗糖的醬油和醬制品樣品添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方式考察方法的回收率和精密度。分別添加3個水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平為4、100、250 mg/kg(MRL)，每個水平平行測定6次。三氯蔗糖的平均回收率為83.2%～95.4%，精密度(RSD)為4.1%～6.3%，結(jié)果表明，建立的前處理方法具有較好的回收率和精密度。回收率和精密度數(shù)據(jù)見表1。

表1 不同樣品中三氯蔗糖的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of sucralose in different samples

圖1為空白醬油樣品(不含三氯蔗糖的樣品)的色譜圖，圖2為空白醬油樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/kg)的色譜圖。比較圖1和圖2可知，在三氯蔗糖出峰時間附近無干擾峰，說明建立的前處理方法凈化效果良好，有效去除雜質(zhì)干擾。

圖1 空白醬油樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank sample

圖2 空白醬油樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/kg)色譜圖Fig.2 Chromatogram of spiked blank sample

2.4 實際樣品檢測

從市場上購買40份醬油和35份醬制品，按照本方法進(jìn)行檢測，醬油中檢出添加三氯蔗糖的樣品9份，占醬油抽樣總數(shù)的22.50%；醬制品中檢出添加三氯蔗糖的樣品3份，占醬制品抽樣總數(shù)的8.57%。在抽檢的醬油和醬制品中，標(biāo)簽標(biāo)識含有三氯蔗糖的樣本均有檢出，未標(biāo)識含有三氯蔗糖的樣本均低于方法檢出限，檢測添加三氯蔗糖的樣品均符合GB 2760—2014最大用量為0.25 g/kg的限量要求。

驗證本研究建立的前處理方法的可靠性，采用GB 22255—2014標(biāo)準(zhǔn)對上述含有三氯蔗糖的醬油或醬制品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，2種方法的三氯蔗糖檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過10%。相同樣品含量及加標(biāo)回收率見表2。

表2 相同樣品中三氯蔗糖的含量與加標(biāo)回收率Table 2 The content and recovery of sucralose in the same sample

注：預(yù)處理1方法為GB 22255—2014法；預(yù)處理2方法為QuEChERS法。

本研究建立的前處理方法與國標(biāo)前處理法相比，對經(jīng)濟成本上而言，由于QuEChERS前處理方法未使用Hlb柱，節(jié)約了實驗成本；從效率上考慮，QuEChERS前處理方法操作更加簡單快速，效率更高，有益于大規(guī)模分析檢測。同時，國標(biāo)法所得待測液，顏色深，受色素影響較大，樣品基質(zhì)效應(yīng)影響較強。

3 結(jié)論

方法學(xué)驗證和實際樣品檢測的結(jié)果表明本研究針對醬油及醬制品的特點，建立的改進(jìn)型QuEChERS前處理方法，具有簡單、快速、回收率高、凈化效果好、成本低等優(yōu)點，適用于大批量樣品的快速檢測，可作為企業(yè)在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控方法。