乙酰肝素酶與糖尿病性腎病的相關(guān)性研究進(jìn)展

熊琪輝（綜述），甘華俠（審校）

（南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2009級(jí)；b.第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南昌 330006）

糖尿病性腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者的重要死因，同時(shí)又是導(dǎo)致腎功能衰竭的一個(gè)重要疾病。早期診斷DN，有利于提高糖尿病患者的生存率、生活質(zhì)量，減少國(guó)家的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前尚缺乏更優(yōu)于尿微量白蛋白的檢測(cè)指標(biāo)，以更早的發(fā)現(xiàn)潛在的DN人群，早期對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，改變DN的發(fā)展及預(yù)后。

硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）為廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎生物組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）和細(xì)胞表面的生物大分子，并且是腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的主要構(gòu)成成分。乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，通過(guò)特異性降解釋放出多種與HS結(jié)合的活性因子［堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子、白介素－2、肝素輔助因子Ⅱ等］，參與許多病理和生理過(guò)程。正常生理?xiàng)l件下，其基因表達(dá)和酶活性受到多種因素調(diào)控，否則其過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)諸多病理過(guò)程發(fā)生，如：腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、血管形成、炎癥和自身免疫反應(yīng)等。

筆者就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于HPA與DN之間相關(guān)性的研究進(jìn)行綜述，以求進(jìn)一步明確二者之間可能存在的關(guān)聯(lián)。

1 HPA概述

1.1 HPA的發(fā)現(xiàn)

M.H??k等［1］于1975年在鼠肝臟組織中發(fā)現(xiàn)一種降解HS側(cè)鏈的內(nèi)切糖苷酶，這是首次對(duì)于HPA存在的報(bào)道。但由于該酶的含量低、性質(zhì)不穩(wěn)定，并缺乏一種高效的檢測(cè)方法，HPA蛋白的分離純化研究遇到了重重困難。直到90年代后期，澳大利亞C.Freeman等［2］才成功建立了一個(gè)能夠快速定量檢測(cè) HPA的方法。隨后I.Vlodavsky等［3－4］的實(shí)驗(yàn)室又分別獨(dú)立完成了HPA cDNA的基因克隆，推動(dòng)了當(dāng)今對(duì)HPA的進(jìn)一步研究。

1.2 HPA的基因定位與結(jié)構(gòu)

HPA基因的單核苷酸全長(zhǎng)序列已經(jīng)明確。該基因定位于4號(hào)染色體q21.3上，從起始密碼子到終止密碼子全長(zhǎng)為40kb，含有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。啟動(dòng)子位于AUG上游2.3kb處，全長(zhǎng)1 758bp，含有可編碼543個(gè)氨基酸多肽的開(kāi)放閱讀框，相對(duì)分子質(zhì)量為61 192，與從血小板中純化的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相近。N末端有親水側(cè)鏈，17和35區(qū)有降解位點(diǎn)，110－170處有親水基團(tuán)，另外有6個(gè)N末端糖基位點(diǎn)。SDS－PAGE分析［5］證實(shí)純化的HPA活性酶是由50kU亞基和8kU亞基非共價(jià)連接而成的異二聚體；有研究［6］證實(shí)，HPA前體酶必須經(jīng)過(guò)蛋白酶解加工過(guò)程才可獲得二聚體活性。

1.3 HPA的生物學(xué)功能及其調(diào)節(jié)

HPA為β葡萄糖苷酸內(nèi)切酶，可以切斷細(xì)胞表面和ECM中乙酰硫酸肝素鹽蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）上的 HS，產(chǎn)生如下生物學(xué)效應(yīng)：1）HSPGs水解，使ECM和GBM穩(wěn)定結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞間質(zhì)屏障功能降低；2）釋放結(jié)合在HS上的bFGF，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂、趨化、微血管形成、膠原纖維降解等多方面作用，加快創(chuàng)面愈合及促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，恢復(fù)凋亡細(xì)胞活力；3）釋放結(jié)合在乙酰肝素上的尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）和組織纖溶酶原激活物（tPA），溶解基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；4）uPA和tPA還可通過(guò)活化表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，ECF），激活ECM中的蛋白質(zhì)酶聯(lián)反應(yīng)，使膜的功能降低，屏障功能減退；5）誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)；6）激活酯酶增強(qiáng)脂質(zhì)代謝。該酶廣泛存在于細(xì)胞膜和ECM中，并保持穩(wěn)定水平，以調(diào)節(jié)乙酰肝素生成和降解平衡，維持機(jī)體組織細(xì)胞正常的增殖、分化、黏附和遷移。

HPA的活性作用受神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、乙酰肝素相關(guān)蛋白和富含組氨酸蛋白肝素類似物的影響。D.Marchetti等［7］在研究黑素瘤的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)、侵襲過(guò)程的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NGF和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子23（NT23）能夠提高HPA的活性，因?yàn)樗鼈兡軌蚺c神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR結(jié)合。然而不能與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR結(jié)合的NGF突變體和非神經(jīng)生長(zhǎng)因子不能提高黑色素瘤細(xì)胞的侵襲力。另外還檢測(cè)了在合成的HSPGs存在情況下RL95細(xì)胞HPA的活性，證實(shí)乙酰肝素鹽相關(guān)蛋白和HPA對(duì)HS特異性識(shí)別有共同的機(jī)制，它們依賴HS的活性可能相互調(diào)節(jié)。

2 HPA與蛋白尿性腎小球疾病

腎小球?yàn)V過(guò)屏障是腎小球的重要結(jié)構(gòu)，由內(nèi)皮細(xì)胞、GBM、足細(xì)胞及其裂孔隔膜三層結(jié)構(gòu)所構(gòu)成，濾過(guò)屏障的完整性在阻止蛋白質(zhì)漏出中起關(guān)鍵作用。HSPGs是一類大分子蛋白聚糖類化合物，由核心蛋白、HS側(cè)鏈、葡胺聚糖側(cè)鏈共價(jià)相連，是GBM的重要組成成分，HS側(cè)鏈上硫酸根和羧基對(duì)GBM陰離子電荷起重要作用。HS一方面富含豐富的負(fù)電荷，可限制帶負(fù)電的血漿白蛋白通過(guò)，另一方面可與GBM中的膠原和層粘連蛋白相互作用維持GBM分子結(jié)構(gòu)的完整性。

一般認(rèn)為，HPA是哺乳動(dòng)物中唯一可以選擇性降解HS側(cè)鏈的糖苷內(nèi)切酶，在脾臟、淋巴結(jié)等免疫組織中均可檢測(cè)到，而在其他正常組織中，如腎臟、心臟等不表達(dá)或低表達(dá)。M.J.van den Hoven等［8］報(bào)道，HPA在人腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)極少，其中在皮質(zhì)髓質(zhì)的小管上皮細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)較高。同時(shí)V.Levidiotis等［9］近來(lái)也報(bào)道HPA在正常大鼠腎臟的腎小球不表達(dá)，在小管上皮細(xì)胞呈低表達(dá)。但是病理狀態(tài)下腎臟HPA的表達(dá)增高（主要是腎小球HPA的表達(dá)增加），從側(cè)面證明了機(jī)體內(nèi)正常水平HPA含量對(duì)于維持腎小球正常生理功能的重要性。

HPA通過(guò)裂解HS側(cè)鏈，破壞HSPGs完整性可導(dǎo)致GBM選擇通透性改變及腎小球上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞錨連位點(diǎn)的喪失。此外，HPA不僅能夠降解HS側(cè)鏈，還使與HS結(jié)合的一系列生長(zhǎng)因子釋放出來(lái)，產(chǎn)生相應(yīng)的繼發(fā)反應(yīng)可能參與了在各種蛋白尿性腎小球疾?。ㄌ悄虿⌒阅I?。?0－11］、動(dòng)物模型的膜性腎病［12］、藥物所致腎病［9，13］、抗基底膜抗體疾病［14］、兒童激素敏感性腎病綜合征［15］、局灶節(jié)段性腎小球硬化性腎病、IgA腎病、微小病變性腎?。?6］、淀粉樣變性?。?7］）的病理生理過(guò)程。

但存在爭(zhēng)議的是，最近有一部分研究顯示HPA可能與腎小球性蛋白尿的發(fā)生發(fā)展并不存在明確的關(guān)聯(lián)。T.J.Wijnhoven等［18］研究表明，不論伴有或不伴有蛋白尿的成年人和兒童腎臟病患者的腎臟HS主鏈表達(dá)沒(méi)有異常。J.van den Bom等［19］研究表明，尿白蛋白排泄率增加可能與腎小球HS的表達(dá)和結(jié)構(gòu)的改變沒(méi)有明確的關(guān)聯(lián)。更有研究［20］提出新的觀點(diǎn)，認(rèn)為HS保持GBM處于一個(gè)“開(kāi)放狀態(tài)”，促進(jìn)蛋白通過(guò)腎小球毛細(xì)血管壁。研究人員給小鼠靜脈應(yīng)用神經(jīng)氨酸苷酶（可水解GBM神經(jīng)氨酸）后導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生白蛋白尿，再加用肝素酶Ⅲ后，電鏡下發(fā)現(xiàn)HS消失，同時(shí)尿中蛋白減少。

3 HPA與DN的相關(guān)性

我國(guó)DN是導(dǎo)致終末期腎病的第二位原因。DN導(dǎo)致蛋白尿形成的機(jī)制有：腎小球內(nèi)毛細(xì)血管跨膜壓力過(guò)高；腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能障礙，包括濾孔改變和電荷改變；腎小球上皮細(xì)胞代謝障礙等。近年來(lái)，人們對(duì)DN分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入，血流動(dòng)力學(xué)紊亂/內(nèi)皮細(xì)胞受損固然是DN蛋白尿的始發(fā)因素，但內(nèi)皮細(xì)胞之間的窗孔較大，在正常情況下即能讓白蛋白自由通過(guò)，GBM則成為真正防止蛋白質(zhì)漏出的第一道屏障。

近年來(lái)有許多的證據(jù)表明，HPA參與了DN的發(fā)生發(fā)展。J.B.Maxhimer等［11］研究表明，在DN的病理狀態(tài)下，可能由于內(nèi)環(huán)境中高水平葡萄糖含量的影響可誘導(dǎo)HPA的表達(dá)增加和基底膜上HS的表達(dá)減少。在體外高糖環(huán)境中培養(yǎng)腎臟上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HPA mRNA的表達(dá)上調(diào)，HPA抑制劑能夠保護(hù)細(xì)胞表面HS的表達(dá)。又有進(jìn)一步的研究［10，21］觀察到，在臨床蛋白尿和微量白蛋白尿的糖尿病患者中HPA的活性是增加的，相對(duì)正常人的尿液中未能檢測(cè)到HPA的活性。唐琳等［22］進(jìn)行的研究表明，DN患者腎組織中HPA表達(dá)升高，并且與尿蛋白量呈正相關(guān)，提示HPA可能參與了DN蛋白尿的發(fā)生。

有研究［23］測(cè)定證實(shí)糖尿病患者血液、尿液中HPA的水平是增高的。DN患者比不并存糖尿病并發(fā)癥者血液、尿液中HPA水平增高更加明顯，DH患者中的血HPA水平的增高，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體中HPA水平的升高，從而影響到其他的器官、組織和細(xì)胞。而接受腎移植后的DN患者尿液中HPA的水平降低，說(shuō)明了HPA可能主要來(lái)源于糖尿病相關(guān)的腎功能衰竭。事實(shí)上，免疫組織化學(xué)研究分析表明，HPA表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，在正常腎臟的腎小球中不表達(dá)；但是在DN的腎小球和腎小管上皮細(xì)胞其表達(dá)上調(diào)［11］。值得注意的是，在糖尿病腎移植患者，除了糖尿病相關(guān)的藥物，還需要應(yīng)用的免疫抑制藥物可能會(huì)影響乙酰肝素酶的分泌。

4 結(jié)語(yǔ)

DN是糖尿病的重要并發(fā)癥，是一種蛋白尿性腎小球疾病，HPA可通過(guò)水解腎小球GBM的重要組成成分HSPGs，導(dǎo)致GBM電荷屏障破壞而在蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。多項(xiàng)研究證明，DN患者機(jī)體中HPA水平的變化參與了DN的病理生理過(guò)程。能否通過(guò)檢測(cè)HPA早期診斷DN，及通過(guò)抑制HPA的表達(dá)是否有助于防治DN的發(fā)生發(fā)展有待于進(jìn)一步的研究。

［1］ H??k M，Wasteson A，Oldberg A.A heparan sulfate－degrading endoglycosidase from rat liver tissue［J］.Biochem Biophys Res Commun，1975，67（4）：1422－1428.

［2］ Freeman C，Parish C R.A rapid quantitative assay for the detection of mammalian heparanase activity［J］.Biochem J，1997，32：229－237.

［3］ Vlodavsky I，F(xiàn)riedmann Y，Elkin M，et al.Mammalian heparanasc：gene cloning，expression and function in tumor progression and metastasis［J］.Nat Med，1999，5（7）：793－802.

［4］ Hulet M D，F(xiàn)reeman C，Hamdori B J，et al.Cloning of mammalian heparanase，an important enzyme in tumor invasion and metastasis［J］.Nat Med，1999，5（7）：803－809.

［5］ Toyoshima M，Nakajima M.Human heparanase［J］.J Biol Chem，1999，274（34）：2413－2416.

［6］ Levy Adam F，Miao H Q，Heinrikson R L，et al.Heterodimer formation is essential for heparanase enzymatic activity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，308（4）：885－891.

［7］ Marchetti D，Reiland J，Erwin B，et al，Inhibition of heparanase activity and heparanase－induced angiogenesis by suramin analogues［J］.Int J Cancer，2003，104（2）：167－174.

［8］ van den Hoven M J，Rops A L，Bakker M A，et al.Increased expression of heparanase in overt diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2006，70（12）：2100－2108.

［9］ Levidiotis V，Kanellis J，lerino F L，et al.Increased expression of heparanase in puromycin aminonucleoside nephrosis［J］.Kidney Int，2001，60（4）：1287－1296.

［10］ Katz A，Van Dijk D J，Aingorn H，et al.Involvement of human heparanase in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Isr Med Assoc J，2002，4（11）：996－1002.

［11］ Maxhimer J B，Somenek M，Rao G，et al.Heparanase－1gene expression and regulation by high glucose in renal epithelial cells：apotential role in the pathogenesis of proteinuria in diabetic patients［J］.Diabetes，2005，54（7）：2172－2178.

［12］ Levidiotis V，F(xiàn)reeman C，Tikellis C，et al.Heparanase is involved in the pathogenesis of proteinuria as a result of glomerulonephritis［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15（1）：68－78.

［13］ Kramer A，van den Hoven M J，Rops A L，et al.Induction of glomerular heparanase expression in rats with adriamycinnephropathy is regulated by reactive oxygen species and therenin－angiotensin system［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17（9）：2513－2520.

［14］ Levidiotis V，F(xiàn)reeman C，Tikellis C，et al.Heparanase inhibition reduces proteinuria in a model of accelerated antiglomerular basement membrane antibody disease［J］.Nephrology，2005，10（2）：167－173.

［15］ Holt R C，Webb N J，Ralph S，et al.Heparanase activity is dysregulated in children with steroid－sensitive nephrotic syndrome［J］.Kidney Int，2005，67（1）：122－129.

［16］ van den Hoven M J，Rops A L，Vlodavsky I，et al.Heparanase in glomerular diseases［J］.Kidney Int，2007，72（5）：543－548.

［17］ Li J P，Galvis M L，Gong F，et al.In vivo fragmentation of heparan sulfate by heparanase over expression renders mice resistant to amyloid protein a amyloidosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（18）：6473－6477.

［18］ Wijnhoven T J，Geelen J M，Bakker M，et al.Adult and paediatfic patients with minimal change nephrotic syndrome show no major alterations in glomerular expression of sulphated heparan sulphate domains［J］.Nephrology Dialysis Transplantation，2007，22（10）：2886－2893.

［19］ van den Bom J，Pisa B，Bakker M A，et al.No change in glomerular heparan sulfate structure in early human and experimental diabetic nephropathy［J］.J Biol Chem，2006，281（40）：29606－29613.

［20］ Wijnhoven T J，Lensen J F，Wisanans R G，et al.In vivo degradation of heparan sulfates in the glomerular basement membrane does not result in proteinuria［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18（1）：823－832.

［21］ Shafat I，Zcharia E，Nisman B，et al.An ELISA method for the detection and quantification of human heparanase［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，341（4）：958－963.

［22］ 唐琳，劉章鎖，竇艷娜，等.乙酰肝素酶在糖尿病腎病患者腎組織的表達(dá)及臨床意義［J］.中華腎臟病雜志，2008，24（11）：845－846.

［23］ Shafat I，Ilan N，Zoabi S，et al.Heparanase levels are elevated in the urine and plasma of type 2diabetes patients and associate with blood glucose levels［J］.PLoS One，2011，6（2）：e17312.