突觸素與慢性腦缺血的研究進展

潘發(fā)福（綜述），呂 誠 （審校）

（南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2008級；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人解教研室，南昌 330006）

慢性腦缺血（chronic cerebral ischemia，CCI）與臨床許多腦血管疾病密切相關(guān)，是多種原因引發(fā)的長期慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的以持久或進展性認知功能障礙為主要表現(xiàn)的一組疾病［1－3］，還是血管性癡呆、Alzheimer病及Binswanger病等多種疾病的共同病理基礎(chǔ)，其主要的病理學(xué)改變包括皮質(zhì)萎縮、皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元變性、白質(zhì)疏松、神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生和毛細血管床的改變等。CCI的主要損傷機制有細胞凋亡、免疫炎性損傷、氧化應(yīng)激損傷、突觸結(jié)構(gòu)和功能異常、能量代謝障礙、中樞膽堿能及單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂等。在CCI發(fā)病機制的研究中，突觸結(jié)構(gòu)的改變和功能的異常受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［3］，突觸作為神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)，突觸的損傷對于記憶的影響極大。

突觸是神經(jīng)元及突起之間神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。突觸傳遞是指突觸前神經(jīng)元的活動經(jīng)突觸引起突觸后神經(jīng)元活動的過程，化學(xué)突觸傳遞一般包括電－化學(xué)－電的過程。突觸前神經(jīng)元興奮傳到其末端時，突觸前膜內(nèi)的突觸囊泡（synaptic vesicles，SV）向突觸前膜移動，通過出胞的形式釋放神經(jīng)遞質(zhì)，遞質(zhì)進入突觸間隙后迅速與突觸后膜上的特異性受體相結(jié)合，使突觸后膜產(chǎn)生突觸后電位［4］。隨著突觸的研究深入，發(fā)現(xiàn)SV上的蛋白有數(shù)種之多，其中突觸素是SV上最豐富的蛋白質(zhì)，占所有SV蛋白的8%。突觸素是完整的萬寶域膜蛋白家族中的一個典型成員，也是最先被識別和克隆的SV蛋白，幾乎所有的萬寶域通道蛋白都參與囊泡膜的沉積和轉(zhuǎn)運。突觸素與SV離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸的形成密切相關(guān)，是突觸功能的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］，其密度和分布可間接反映體內(nèi)突觸的數(shù)量及分布情況，與突觸的重建及認知過程密切相關(guān)［6］，可作為研究神經(jīng)系統(tǒng)退化、損傷及再生、發(fā)育成熟的標記物。

1 突觸素的分布

突觸素是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的膜蛋白，幾乎在所有中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的突觸終末內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有突觸素。用免疫組織化學(xué)的方法檢測突觸，發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸素主要分布于皮質(zhì)內(nèi)，如海馬的神經(jīng)氈區(qū)、大腦皮質(zhì)內(nèi)等部位。海馬是進行信息貯存的重要部位，也是研究突觸可塑性理論的最佳單位，大量實驗提示，學(xué)習(xí)記憶功能與海馬有密切的聯(lián)系［7］。突觸素在海馬的神經(jīng)氈區(qū)呈現(xiàn)顆粒狀或點狀免疫標記，而神經(jīng)元胞體、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、白質(zhì)及血管不被標記。海馬和齒狀回出現(xiàn)明顯免疫標記板層分布，海馬區(qū)多形層和輻射層染色較深，腔隙分子層次之；而齒狀回則以分子層染色最深，并分為內(nèi)、中、外帶，內(nèi)、外帶較中帶深［8］。 P.Redecker等［9－10］在研究中發(fā)現(xiàn)突觸素在神經(jīng)系統(tǒng)軸突末梢強烈表達，呈顆粒狀分布，而在細胞質(zhì)和神經(jīng)節(jié)細胞中沒有發(fā)現(xiàn)突觸素的存在，并且突觸素免疫組織化學(xué)檢測可能有助于檢測神經(jīng)元退化。 有資料研究顯示:Schizophrenia患者額葉皮質(zhì)第9區(qū)和第40區(qū)突觸素與正常人相比明顯降低，說明額葉皮質(zhì)中也有突觸素的存在［11］。 潘三強等［12］研究，大鼠下丘腦和背側(cè)丘腦突在空間記憶是突觸素的變化時發(fā)現(xiàn)觸素呈顆粒狀，在下丘腦顆粒大小不一，上部和下部分布較少，中部分布較均勻，表達較強；在背側(cè)丘腦顆粒大小一致，分布均勻。

突觸素除了存在于神經(jīng)組織中，還存在于其他非神經(jīng)組織內(nèi)分泌細胞中。如甲狀腺C細胞、胃腸黏粘膜內(nèi)分泌細胞、腎上腺髓質(zhì)細胞中均發(fā)現(xiàn)有突觸素的存在。突觸素存在于圓形或卵圓形表面光滑的小泡膜上，這些小泡主要見于中心體和高爾基復(fù)合體周圍，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上少有分布，而在線粒體上未見分布［13］。突觸素的分布受突觸素抗體的特異性而不同，表達的多少與實驗動物的種類、部位、研究方法等諸多因素影響，其實驗結(jié)果也有一定的差異。

2 突觸素的結(jié)構(gòu)

突觸素是一38 kDa的整合膜蛋白，這個膜蛋白是參與囊泡運輸及胞膜連接相關(guān)蛋白質(zhì)家族中的一員，包含有307個氨基酸。在哺乳動物其氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)由4個跨膜區(qū)、1個螺旋、2個intravesi介子循環(huán)以及細胞質(zhì)N和C末端組成。在C端含有一個Ca2＋結(jié)合部位和十五肽重復(fù)序列，其中9個包含酪氨酸殘基在膜外，可被絡(luò)氨酸磷酸化［14］。其空間結(jié)構(gòu)是和六聚體一樣復(fù)雜封閉的構(gòu)像，由6個輻條形成籃狀物從中央向外輻射，在膜和擴展的胞漿膜側(cè)，開放的構(gòu)象上有面向囊泡腔以及細胞膜內(nèi)的大孔，結(jié)構(gòu)也顯示了明顯的通道作用和參與到囊泡循環(huán)。當改為一個平面脂質(zhì)雙層膜，突觸素形成多聚體，該結(jié)構(gòu)類似于多聚機械敏感性通道和縫隙連接半管，其結(jié)構(gòu)和整體尺寸也十分相似，并符合突觸素作為神經(jīng)遞質(zhì)假設(shè)的作用通道，在許多生物結(jié)構(gòu)中都能看到［15－17］。

3 突觸素的生理功能

突觸素是SV上最豐富的蛋白質(zhì)，它是如何參與SV循環(huán)和在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中的發(fā)揮作用呢？突觸素參與SV內(nèi)吞作用的證據(jù)是突觸素與SV胞外分泌后迅速回收的內(nèi)吞形式有關(guān)連［18］。它參與囊泡循環(huán)的某個階段，作為萬寶域膜蛋白家族中的一員更加表明它可能在融合和回收中起作用，并且它在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中起很重要調(diào)節(jié)作用，會影響記憶和學(xué)習(xí)現(xiàn)象。

在突觸前膜和回收活動區(qū)有2種囊泡融合機制:充分融合和瞬間融合［19］。在充分融合模型中，由于囊泡表面上的Synaptobrevin（Syb）和突觸前膜上Syntaxin（Syx）的潛在相互作用使SV?？吭谕挥|前膜，這2種蛋白通過SNAP25和SNARE復(fù)合體潛在的結(jié)合在一起［20］。 當突觸前膜去極化，Ca2＋內(nèi)流，Synaptotagmin I（Syt I）結(jié)合到 SNARE 復(fù)合體，它的鈣離子結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域與細胞膜形成一個緊密靜電作用。隨后是網(wǎng)羅復(fù)雜（Syx，Syb和SNAP25）的卷曲，從而SV與細胞膜充分融合［21］。在瞬間融合過程中，SV也是在細胞膜去極化和Ca2＋內(nèi)流后靠近突觸前膜。但是SV從來沒有完全與細胞膜融合，而是只形成了一個短暫的融合孔釋放神經(jīng)遞質(zhì)，完整的SV最終從膜再融合中釋放出來。目前短暫融合的分子機制還不清楚［22－23］。

Syb綁定到多個SV蛋白是肯定的，包括Syt I和Syt IV，形成特有的 SNARE 復(fù)合體［24－25］。 SytI是充分融合中鈣離子的主要傳感器。在鈣離子內(nèi)流，Syt I結(jié)合的SNARE復(fù)合體與鈣離子結(jié)合，Syt I C2結(jié)構(gòu)域與突觸前膜形成緊密靜電相作用，將囊泡拉入突觸前膜，然后形成復(fù)雜的突觸素與細胞膜的融合孔。Syt I與質(zhì)膜的強相互作用允許形成完全的SNARE復(fù)合體，這種強相互作用將Syb從突觸素復(fù)合體中解離出來，從而允許突觸素六聚體游離和發(fā)生充分囊泡融合。Syt IV在瞬間融合中有牽連作用［26］。在瞬間融合通路中，Syt IV是主要的鈣離子傳感器，Syt IV和Syb的相互作用較弱。鈣離子內(nèi)流，只有Syt IV的C2B鈣離子結(jié)合域發(fā)生結(jié)合，Syt IV與突觸前膜將導(dǎo)致較弱的電反應(yīng)。Syb能抑制突觸素進入網(wǎng)羅復(fù)雜卷曲的SNARE復(fù)合體，以及保持突觸素與Syb復(fù)合體的穩(wěn)定，與Syx形成融合孔，并已被證明在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中有活性［27］。Syt IV的表達增加導(dǎo)致瞬間融合事件增加，Syt IV的減少導(dǎo)致了神經(jīng)遞質(zhì)釋放障礙和 SV 的丟失［28］。

4 突觸素與CCI的關(guān)系研究

突觸素作為SV膜上的蛋白質(zhì)，它表達的多少可以反映記憶能力的高低。李濤［29］用兩血管法制作CCI模型，發(fā)現(xiàn)CCI模型大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期較正常大鼠明顯延長，其海馬結(jié)構(gòu)中的突觸素表達明顯降低，顏色淺，連續(xù)性中斷，無法襯托出神經(jīng)元的輪廓。韓肖華等［30］利用大腦中動脈栓塞建造CCI模型，發(fā)現(xiàn)梗死后突觸素表達與對照組有明顯差異，突觸素表達在不同時間段有所不同，且變化與大鼠的行為學(xué)功能上一致。S.N.Thompson 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷后突觸素的表達發(fā)生動態(tài)變化，推論突觸素不僅是神經(jīng)損傷的標志，而且在神經(jīng)元可塑性和修復(fù)方面有重要作用。沈瑞樂等［32］研究CCI老齡大鼠海馬中突觸素的表達特征，發(fā)現(xiàn)缺血組海馬結(jié)構(gòu)中CA1、CA3和齒狀回3處突觸素的表達明顯減少、稀疏，膠質(zhì)細胞增多。并推測其可能原因:1）軸突終末的丟失。CCI后，神經(jīng)元的受損導(dǎo)致軸突終末的蛻變丟失。2）突觸素的合成減少。腦缺血后神經(jīng)元的代謝減弱及蛋白質(zhì)的合成能力下降，使軸突終末的突觸素減少。洪岸等［8］對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶減退與海馬結(jié)構(gòu)的突觸素改變的研究中發(fā)現(xiàn)，記憶損害大鼠較記憶正常大鼠海馬結(jié)構(gòu)突觸素免疫組織化學(xué)染色灰度顯著降低，老年大鼠平均逃避潛伏期分別與其海馬CA1區(qū)多形層、輻射層、腔隙分子層和齒狀回分子層外帶突觸素免疫組織化學(xué)灰度值呈負相關(guān)。 U.Schmitt等［33］探討研究突觸素表達水平變化與學(xué)習(xí)記憶之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，海馬神經(jīng)細胞變性壞死，隨時間延長，壞死逐漸增多，突觸素陽性產(chǎn)物表達明顯減少，大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力均下降，各種行為學(xué)測試均與正常大鼠存在明顯差異。 H.Ishimaru 等［34－35］對 CCI突觸素進行研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)扎雙側(cè)頸動脈的大鼠2 d后海馬突觸素表達明顯減少（約60%），隨時間推移其相關(guān)蛋白質(zhì)表達增加，尤其在14 d后表達最多；到了30 d后，突觸終端出現(xiàn)病理損害，突觸素水平又出現(xiàn)顯著降低（約60%）。這些結(jié)果表明，缺血后在海馬CA1區(qū)突觸發(fā)生變性，而且先于神經(jīng)元遲發(fā)性死亡。以上結(jié)論提示，CCI后海馬結(jié)構(gòu)和突觸素均發(fā)生改變，不同的時間段突觸素表達不同，病理變化亦不同，突觸素的動態(tài)改變和組織細胞的增生，提示腦缺血后突觸的損傷和重建。

5 結(jié)語與展望

目前臨床上針對慢性腦缺血的不同病理機制采取了許多不同的治療方法，但效果不是很理想。隨著我國老齡人口的不斷增加、人均壽命的增長，CCI的發(fā)病率在逐年升高，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。與急性腦缺血相比，CCI具有較長的臨床前期可供干預(yù)，其研究的重點主要是以氧化應(yīng)激損傷、突觸結(jié)構(gòu)及功能障礙等不同病理機制為靶點的動物實驗研究。突觸素作為一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的膜蛋白，與CCI等多種神經(jīng)疾病密切相關(guān)，也成為近年來的研究熱點。相信，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及應(yīng)用，突觸素在CCI疾病中的應(yīng)用研究將取得更大的進展。

［1］Ueno Y， Zhang N，Miyanoto N，et al.Edaravone attenuates white matter lesions through endothelial protection in a rat choronic hypoperfusion model［J］.Neuroscience，2009，162（2）:317－327.

［2］Mracskóa(chǎn) E，Hugyecz M，Institóris A，et al.Changes in pro－oxidant and antioxidant enzyme levels during cerebral hypoperfusion in rats［J］.Brain Res，2010，1321:13－19.

［3］憊云安.慢性腦缺血對大鼠認知功能障礙及影響機制研究［J］.四川醫(yī)學(xué)，2010，31（9）:1126－1128.

［4］朱長庚.神經(jīng)解剖學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:151－189.

［5］Lauri S E，Lamsa K，Pavlov I，et al.Activity blockade increases the number of functional synapses in the hippocampus of newborn rats［J］.Mol Cell Neurosci，2003，22（1）:107－117.

［6］Joca S R，Guimaraes F S，Del Bel E.Inhibition of nitric oxide synthase increases synaptophysin mRNA expression in the hippocampal formation of rats［J］.Neurosci Lett.2007，421（1）:72－76.

［7］Morris R G.Elements of a neurobiological theory of hippocampal function:the role of synaptic plasticity，synaptic tagging and schemas［J］.Eur J Neurosci，2006， 23（11）:2829－2846.

［8］洪岸，姚志斌，顧耀銘，等.老年大鼠學(xué)習(xí)記憶減退與海馬結(jié)構(gòu)的突觸素改變［J］.解剖學(xué)報，1996，27（2）:164－168.

［9］Redecker P，Grube D.Synaptophysin imNervensystem und in endokrinen Zellen ［J］.Acta Histochemica，1992，42:33－38.

［10］Hilbe M，Guscetti F，Wunderlin S，et al.Synaptophysin:an Immunohis-tochemical markerfor animal dysaut on omias［J］.Comp Path，2005，132（2／3）:223-227.

［11］Glantz L A，Austin M C，Lewis D A.Normal cellular levelsofaynaptophysin mRNA expression in the prefrontal cortex of subjects with schizophrenia［J］.Biol Psychiatry，2000，48（5）:389－397.

［12］潘三強，宿寶貴，韓輝，等.大鼠下丘腦和背側(cè)丘腦在空間記憶時突觸素的變化［J］.暨南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2001，24（4）:13－17.

［13］Buffa R，Rindi G，Sessa F，et al.Synaptophysin immun orea ctivity and small clear vesicles in neuroend ocrine cells and related tumours？molecular and cellu lar probes［J］.Mol Cell Probes，1987，1（4）:367－381.

［14］Evans G J，Cousin M A.Tyrosine phosphorylation ofsynaptophysin in synaptic vesicle recycling［J］.Biochem Soc Trans，2005，33（6）:1350－1353.

［15］Bass R B，Strop P，Barclay M，et al.Crystal structureof escherichia coli MscS，a voltage－modulated and mecha nosensitivechannel［J］.Science，2002，298（5598）:1582－1587.

［16］Felkl M，leubu R E.Interaction assays in yeast and cultured cells confirm known and identify novel partners of the synaptic vesicle protein synaptophysin ［J］.Neuroscience，2008，156（2）:344－352.

［17］Perozo E，Cortes D M，Sompornpisut P，et al.Open channel structure of MscL and the gating mechanismof mech anosensitive channels［J］.Nature，2002，418（6901）:942－948.

［18］Dittman J S，Kaplan J M.Factors regulating the abund anceand localization of synaptobrevin in the plasma membrane［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（30）:11399－11404.

［19］Sudhof T C.The synaptic vesicle cycle revisited［J］.Neuron，2000，28（2）:317－320.

［20］Tang J，Maximov A，Shin O H，et al.A complexin／synaptotagmin 1 switch controls fastsynaptic vesicle exocytosis［J］.Cell，2006，126（6）:1175－1187.

［21］Hui E，Bai J，Chapman E R.Ca2＋－triggered simul taneous membrane penetration of the tandem C2－domains of synaptotagminI［J］.Biophys J，2006，91（5）:1767－1777.

［22］Fernandez Alfonso T，Ryan T A.The kinetics of syna pticvesicle pool depletion at CNS synaptic terminals［J］.Neuron，2004，41（6）:943－953.

［23］Harata N C，Aravanis A M，Tsien R W.Kiss－and－run and full－collapse fusion as modes of exo－endocytosis in neurosecretion［J］.J Neurochem，2006，97（6）:1546－1570.

［24］Pennuto M，Dunlap D，Contestabile A，et al.Fluorescence resonance energy transfer detection of synaptophysinI and vesicle－associated membrane protein 2 interaction sduring exocytosis from single live synapses［J］.Mol Biol Cell， 2002，13（8）:2706－2717.

［25］Fukuda M.Vesicle －associated membrane protein －2／synaptobrevinbinding to synaptotagmin I promotes O－glycosylation of synaptotagmini［J］.J Biol Chem，2002，277（33）:30351－30358.

［26］Wang C T，Lu J C，Bai J，et al.Different domains of synaptotagmin controlthe choice between kiss－and－run and full fusion［J］.Nature，2003，424（6951）:943－947.

［27］Han X，Wang C T，Bai J，et al.Transmembrane segments of syntaxin line the fusion pore of Ca2＋－triggered exocytosis［J］.Science，2004，304（5668）:289－292.

［28］Ferguson G D，Anagnostaras S G，Silva A J，et al.Deficits in memory and motor performance in synaptotagmin IVmutant mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（10）:5598－5603.

［29］李濤.骨髓間充質(zhì)干細胞對VaD大鼠突觸素表達的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（23）:3－4.

［30］韓肖華，黃曉琳，王熠釗，等.電針結(jié)合重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對腦缺血大鼠海馬突觸素的影響［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（12）:1057－1060.

［31］Thompson S N，Gibson T R，Thompson B M，et al.Relati onship of calpain－mediated proteolysis to the expression of axonal and synaptic plasticity markers following traumatic brain injury in mice［J］.Exp Neurol，2006，201（1）:253－265.

［32］沈瑞樂，郭鐵，滕軍放.慢性腦缺血老齡大鼠海馬中突觸素的表達特征［J］.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2008，11（10）:35－37.

［33］Schmitt U，Tanimoto N，Seeliger M，et al.Detection of behavioral alterations and learning deficits in mice lacking synaptophysin［J］.Neuroscience，2009，162（2）:234－243.

［34］Ishimaru H，Casamenti F，Uéda K，et al.Changes in presynaptic proteins， SNAP－25 and synaptophysin， in the hippocampal CA1 area in ischemic gerbils［J］.Brain Res，2001，903（1／2）:94－101.

［35］Liu H X，Zhang J J，Zheng P，et al.Altered expression of MAP－2，GAP－43，and synaptophysin in the hippoc ampus of rats with chronic cerebral hypoperfusion correlates with cognitive impairment［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，139（1）:169－177.