熱休克蛋白70與心肌細(xì)胞的凋亡

童金英(綜述），朱清仙(審校）

（南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2008級(jí)；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南昌 330006）

1962年F.M.Ritossa將果蠅的培養(yǎng)溫度提高后，發(fā)現(xiàn)了熱休克反應(yīng)，1974年A.Tissieres等[1]進(jìn)一步研究分離出熱休克蛋白 （heat shock protein,HSP）。HSP是機(jī)體除熱應(yīng)激外，在寒冷、缺血、機(jī)械刺激、有毒化合物等應(yīng)激條件下迅速合成的一組蛋白質(zhì)，也稱熱應(yīng)激蛋白。HSP家族被分為：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子 HSP，其中 HSP70是研究較多的蛋白質(zhì)之一［2］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在探索HSP70的特性及其在心臟疾病治療中的作用,HSP70在心肌細(xì)胞中的抗凋亡作用和心肌保護(hù)作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)[3]。本研究對(duì)熱休克蛋白及其對(duì)各種應(yīng)激條件下心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 HSP70的分類、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性

1.1 HSP70的家族成員

HSP70的家族成員最多，共有21種蛋白質(zhì)[4]，大致分為以下 4 類：1）HSP（70），也稱為 HSP72，其主要存在于胞漿中，胞核通常在正常情況下并不表達(dá)或表達(dá)量很少，但在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激作用下迅速增加表達(dá)，屬于誘導(dǎo)型HSP70；2）熱激同源蛋白70（heat shock cognate 70），也稱為 HSP73，在所有細(xì)胞的胞漿和胞核中均有所表達(dá)，為結(jié)構(gòu)型HSP70，與HSP70具有高度的序列同源性（95%）和相似的生物化學(xué)特性；3）葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose regulated protein78,GRP78），存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞內(nèi)；4）GRP75，位于線粒體內(nèi)。

1.2 HSP70的功能結(jié)構(gòu)

HSP70是一組在進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白[4]，具有3個(gè)功能域：1）近N端是高度保守的序列，又稱核苷結(jié)合域（nudeotide biding dowain,NBD），由 4個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)組成，結(jié)合并水解ATP；2）緊接著是多肽結(jié)合域（peptide biding domain,PBD）,屬相對(duì)保守序列，包含2個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)，形成多肽結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)，可與底物相結(jié)合，識(shí)別靶多肽并與之結(jié)合調(diào)節(jié)其合成的作用；3）近C端是結(jié)構(gòu)多變序列，與特定的蛋白底物結(jié)合有關(guān)。

1.3 HSP70的生物學(xué)特性

目前HSP70被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞HSP中最重要的，這與它所具有的以下生物學(xué)特性密切相關(guān)：1）生物界的普遍性。從原核生物到真核生物都有HSP70的表達(dá)，同一種生物體內(nèi)的不同組織內(nèi)均有表達(dá)。2）高度的保守性。不同生物來(lái)源的HSP70氨基酸序列有50%～90%同源性。3）正常情況下HSP70在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較低，而在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激作用下迅速增加HSP70合成，以提高抗應(yīng)激能力。4）正常情況下HSP70位于細(xì)胞漿，當(dāng)細(xì)胞遭受應(yīng)激作用時(shí)，HSP70迅速移入細(xì)胞核內(nèi)并包圍核仁，胞漿內(nèi)只有少量表達(dá)，而應(yīng)激消除后細(xì)胞處于恢復(fù)階段時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)的HSP70又返回胞漿，在細(xì)胞漿內(nèi)呈低水平表達(dá)，再次應(yīng)激又重新返回細(xì)胞核。5）HSP70家族成員均具有與核苷酸特別是與ATP或ADP結(jié)合的特性。

2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的應(yīng)激條件下發(fā)生的自主有序的死亡。許多信號(hào)刺激可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,如紫外線照射和電離輻射、抗癌藥物、生長(zhǎng)因子缺乏、過(guò)度表達(dá)某些特定的癌基因等。盡管這些信號(hào)以及隨后的反應(yīng)途徑多種多樣,但現(xiàn)已公認(rèn),細(xì)胞凋亡后期的共同途徑是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases）的激活[5]。激活的Caspases可以水解包括細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)、組織平衡、細(xì)胞存活等環(huán)節(jié)中重要的蛋白，從而使細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)特征。

線粒體在細(xì)胞凋亡中起著決定性的作用。線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的一點(diǎn)在于它可釋放能夠激活Caspases的蛋白。從線粒體釋放的細(xì)胞色素C與ApaH、Procaspase 9結(jié)合在一起形成凋亡體(Apoptosome)，并使caspase-9激活。除細(xì)胞色素C之外,線粒體還可釋放其他介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子:Procaspase-3和凋亡誘導(dǎo)因子AIF(Apoptosis-inducing factor)。

3 HSP70與細(xì)胞凋亡

S.A.Gordon等[6]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱休克預(yù)處理產(chǎn)生的抗凋亡作用是由HSP70介導(dǎo)的，并能抑制多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有研究[7]證明：HSP70可以通過(guò)以下途徑對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程進(jìn)行阻斷。

3.1 穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白質(zhì)

在應(yīng)激情況下，變性蛋白失去正常的三維結(jié)構(gòu)，暴露出隱藏在內(nèi)部有著與HSP70高度親和性的疏水性位點(diǎn)，HSP70作為主要的分子伴侶蛋白，與這些應(yīng)激過(guò)程錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)結(jié)合，降低產(chǎn)生不溶性聚集物的危險(xiǎn)性，加速受損傷蛋白質(zhì)的再折疊，對(duì)應(yīng)激細(xì)胞具有早期保護(hù)作用[8]。

3.2 阻止細(xì)胞色素c/caspase-9/Apaf-1凋亡體形成

從線粒體釋放的細(xì)胞色素C能與凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1,A-paf-1)和caspase-9形成凋亡體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究[9]發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HSP70能抑制Caspase-3的活性，起到抗凋亡的作用。HSP70還能與腫瘤抑制蛋白PHAPI、凋亡易感蛋白CAS共同作用，加速Apaf-1的核苷交換，阻止無(wú)活性的Apaf-1/細(xì)胞色素C聚合，從而加速凋亡體的形成。

3.3 阻止凋亡誘導(dǎo)因子AIF從線粒體釋放及入核

AIF是位于線粒體內(nèi)膜的黃素蛋白，在凋亡信號(hào)刺激時(shí)，AFI分子從線粒體釋放到胞漿，再通過(guò)其核定位信號(hào)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，直接引起染色體聚集、核呈大片段斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這個(gè)過(guò)程是caspase非依賴的。研究發(fā)現(xiàn)AIF的150-228位氨基酸殘基與HSP70結(jié)合后，不能入核促使DNA片段化引起細(xì)胞凋亡，通過(guò)HSP70其ATP酶結(jié)構(gòu)域和EEVD伴侶基序與AIF結(jié)合，并將從線粒體泄漏的AIF扣押在細(xì)胞質(zhì)中，避免細(xì)胞凋亡[10]。

3.4 抑制應(yīng)激活化蛋白激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)

活化蛋白激酶JNK是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中關(guān)鍵性的應(yīng)激激酶。在多種應(yīng)激的情況下，活化的JNK可以通過(guò)磷酸化p53和Myc蛋白，或通過(guò)磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X促進(jìn)細(xì)胞色素c自線粒體釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而同樣獲得增強(qiáng)的HSP70通過(guò)阻斷信號(hào)通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的SAPK/JNKs激活，阻斷JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]；HSP70對(duì)JNK的活化抑制機(jī)制可能與清除異常蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積聚有關(guān)，與誘導(dǎo)型 HSP70的蛋白保護(hù)或再折疊作用機(jī)制不相關(guān)。

3.5 抑制凋亡基因P53、Bax的表達(dá)

有研究[6]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HSP70表達(dá)能抑制P53和P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并明顯減少Bax表達(dá)的上調(diào)，而對(duì)Bcl-2的表達(dá)無(wú)影響，HSP70可能通過(guò)抑制P53而防止P53介導(dǎo)的Bax基因的轉(zhuǎn)錄激活，但是，HSP70、P53和Bax之間的關(guān)系不完全清楚，還需要進(jìn)一步研究。

4 HSP70與抑凋亡蛋白Bcl-2家族的關(guān)系

細(xì)胞凋亡區(qū)別于細(xì)胞壞死的一個(gè)顯著特征即受基因調(diào)控，Bcl-2基因是目前較為公認(rèn)的與凋亡密切相關(guān)的基因家族。已在哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)的Bcl-2基因蛋白家族由抑制凋亡的相關(guān)蛋白A1、Bcl-2、Bcl-X1、Mcl-1 等，及促進(jìn)凋亡蛋白 Bak、Bax、Bid、Bik、BNIP3等組成。Bcl-2蛋白是第一個(gè)被確認(rèn)有抑制凋亡作用的基因[12]。Bcl-2蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是多種途徑的共同作用：1）Bcl-2和Bax的比例調(diào)節(jié)凋亡發(fā)生，Bcl-2和Bax既可以形成同源二聚體形式誘導(dǎo)凋亡，也可以形成異源二聚體“中和”凋亡[13]；2）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的 Bcl-2，通過(guò)阻斷 Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的流動(dòng)，降低核酸內(nèi)切酶活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡；3）Bcl-2抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能；4）對(duì)線粒體功能的保護(hù)作用:Bc1-2、Bc1-xl插入線粒體外膜，通過(guò)形成離子通道，幫助H+轉(zhuǎn)運(yùn)出線粒體，從而維持線粒體完整性。Bax促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，釋放出caspase-9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

HSP70與Bcl-2有一些相似之處，如二者均在線粒體上有表達(dá)、均有抗氧化損傷作用、對(duì)一些凋亡因子引起的細(xì)胞凋亡均有抑制作用、對(duì)caspase-3有抑制作用等。經(jīng)線粒體通路介導(dǎo)的凋亡信號(hào)其重要的特征是凋亡體的形成，HSP70可以通過(guò)阻斷細(xì)胞色素C的釋放，阻斷Apaf-1寡聚化及阻斷caspase-9的活化等多重環(huán)節(jié)阻斷凋亡體的形成[15]，對(duì)線粒體通路介導(dǎo)凋亡體形成的不同階段發(fā)揮阻斷作用。而且，在某些細(xì)胞凋亡中，二者有協(xié)同作用。

有研究表明，熱耐受既能誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)，也能誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)；HSP70的過(guò)量表達(dá)也不會(huì)影響B(tài)cl-2的表達(dá)。盡管HSP70與Bcl-2的抗凋亡作用機(jī)制是否相同、二者關(guān)系如何，目前尚不清楚，但它的抗凋亡作用在許多方面得到了證實(shí)[16]。

5 HSP70抗心肌凋亡作用的研究現(xiàn)狀

近年來(lái)關(guān)于心肌保護(hù)的研究多注重于調(diào)動(dòng)心臟內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，以提高心肌細(xì)胞自身耐受缺氧的能力。而HSP70已被證實(shí)是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種重要的內(nèi)源性保護(hù)因子。

心肌缺血再灌注可導(dǎo)致細(xì)胞的壞死和凋亡[17]，細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)之一。最近,A.Laubriet等[18]發(fā)現(xiàn)，HSP70和p53均在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中有明顯變化，而后者又是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因,HSP70與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性很可能是通過(guò) p53為中介的。H.Fliss等[19]采用原位末端標(biāo)記法和瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)缺血及灌注期均可發(fā)生凋亡，但與缺血及灌注時(shí)相有關(guān)。F.Nomura等[20]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱休克預(yù)處理24 h后的綿羊在心肌缺血再灌注后,心室功能、內(nèi)皮功能及有氧代謝的恢復(fù)明顯優(yōu)于對(duì)照組,誘導(dǎo)型HSP在熱休克15 min后即出現(xiàn),并持續(xù)到24 h后，提示HSP在心肌缺血后的自我保護(hù)作用中起著重要作用 。王喬等[21]用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前隆支法建立大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HSP70表達(dá)，用TUNEL技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，在急性心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中，HSP70和細(xì)胞凋亡均呈現(xiàn)明顯地動(dòng)態(tài)性表達(dá)并有著明顯的相關(guān)性；HSP70的代償性增加可能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是誘發(fā)HSP70表達(dá)的一個(gè)重要機(jī)制。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們更加深入地研究了HSP70在心肌缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用。J.Jayakumar等[22]研究證明，采用 HSP70轉(zhuǎn)染的方法可以加強(qiáng)對(duì)心臟機(jī)械和內(nèi)皮功能的保護(hù)；HSP70表達(dá)的代償性增加可能抑制心肌細(xì)胞凋亡從而成為心肌保護(hù)的一種理論依據(jù)。這與K.Suzuki等[23]的發(fā)現(xiàn)大體一致。K.Suzuki等[23]通過(guò)大鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注日本脂質(zhì)體血凝病毒基因轉(zhuǎn)染和在體外通過(guò)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)HSP70的過(guò)度表達(dá)，結(jié)果顯示：試驗(yàn)組心臟自主復(fù)跳的時(shí)間、血清肌酸磷酸激酶水平、缺口末端標(biāo)記法中心肌細(xì)胞陽(yáng)性染色的百分率明顯少于對(duì)照組，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA片段，試驗(yàn)組明顯少于對(duì)照組，充分說(shuō)明了 HSP70的過(guò)度表達(dá)減少了心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

J.Jayakumar等[22]通過(guò)轉(zhuǎn)染HSP70基因到大鼠心臟后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因大鼠心臟缺血再灌注后心功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對(duì)照組，肌酸磷酸激酶漏出減少。提示HSP70的過(guò)度表達(dá)可能在心肌損傷中起著保護(hù)作用,HSP70基因轉(zhuǎn)染可通過(guò)增強(qiáng)自我保護(hù)作用而成為心肌保護(hù)的一種獨(dú)特的方式。

更多應(yīng)激條件下的心肌凋亡蛋白的表達(dá)與HSP70表達(dá)的研究開(kāi)始實(shí)施。池一凡等[24]建立langendorff離體心臟灌注模型，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射重酒石酸去甲腎上腺素，然后運(yùn)用免疫組化測(cè)定心肌HSP 70、Bcl-2、Bax蛋白的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組 HSP70含量較對(duì)對(duì)照組明顯升高，Bcl-2的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，Bax的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，從而得出心肌HSP70高表達(dá)能促進(jìn)心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，減少促凋亡蛋白Bax表達(dá)，增加Bcl-2/Bax概率，抑制心肌細(xì)胞凋亡。張偉華等[25]研究報(bào)道，利用體外培養(yǎng)大鼠、乳鼠心肌細(xì)胞同時(shí)溫度誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生HSP70，H2O2造成心肌損傷，發(fā)現(xiàn)溫度誘導(dǎo)后HSP70在胞漿中大量表達(dá)，保護(hù)組凋亡率顯著低于損傷組，Bcl-2和Caspase-3在損傷組大量表達(dá)，提示HSP70可延遲細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

S.Okubo等[26]將單純載體、腺病毒·LacZ基因(Ad·LacZ)、腺病毒·HSP70(Ad·HSP70)基因分別轉(zhuǎn)移入兔的心肌中，然后經(jīng)過(guò)30 min缺血和3 h再灌注 ,發(fā)現(xiàn) Ad·HSP70組的心肌梗死面積減少,而且這種保護(hù)作用僅表現(xiàn)在注射部位,在非注射部位沒(méi)有明顯的保護(hù)作用。充分說(shuō)明了通過(guò)體內(nèi)兔心肌HSP70基因轉(zhuǎn)移減少了 I/R心肌的梗死面積，HSP70的代償性增加是心肌損傷的一種重要自我保護(hù)作用。

總之，細(xì)胞凋亡不僅僅是心肌損傷的標(biāo)志,可能也是通過(guò)加強(qiáng)某些應(yīng)激蛋白的表達(dá)及其他途徑而產(chǎn)生對(duì)心肌的保護(hù)作用。作為分子伴侶的HSP70，它的表達(dá)不僅僅是心肌缺血再灌注損傷的標(biāo)志，也起到通過(guò)抗氧化和抗凋亡等機(jī)制加強(qiáng)對(duì)心肌多方面的保護(hù)作用，這為臨床上尋求新的心肌保護(hù)途徑以及基因工程和藥物的治療開(kāi)發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。但具體的調(diào)控機(jī)制及如何利用該作用進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)，有待于深入研究。

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