植物中多酚的研究進(jìn)展

于 帥，杜 彬，楊越冬，王同坤

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

植物多酚是含有酚羥基和羧基的一類代謝產(chǎn)物成分，自然界中發(fā)現(xiàn)的酚酸類物質(zhì)的主要骨架類型有C6-C1型和C6-C3型，廣泛存在于蔬菜、水果、豆類、谷物類、茶等植物中［1］。多酚的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其具有很多的藥理功能，如:抗腫瘤、抗突變、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等［2～7］，已廣泛應(yīng)用在食品、化妝品、日用化學(xué)品、醫(yī)藥以及保健品等領(lǐng)域［8］。

隨著天然產(chǎn)物開發(fā)的逐漸興起，植物多酚因其在植物界分布的廣泛性、生理功能的多樣性以及來源豐富性等特點(diǎn)，逐漸成為當(dāng)前天然產(chǎn)物化學(xué)研究的熱點(diǎn)［9］。近年來，人們通過比較不同植物或不同品種植物中總多酚含量，試圖從食品或藥材中尋找富含多酚的植物材料，以便進(jìn)一步開發(fā)利用多酚［10～12］，目前研究較多的有蘋果多酚，茶多酚，葡萄多酚，柑橘多酚等［13，14］。筆者在此重點(diǎn)討論植物多酚的提取、分離及測定方法。

1 多酚類物質(zhì)的提取

目前對植物多酚的提取工藝研究較多，植物多酚的提取技術(shù)已經(jīng)由傳統(tǒng)的提取法逐漸轉(zhuǎn)向新提取技術(shù)［15，16］。其中傳統(tǒng)的提取法有溶劑浸提法和金屬離子沉淀法，近幾年來出現(xiàn)了一些新的方法，如:樹脂吸附法、微波提取法、超聲波提取法及超臨界流體萃取法等。

1．1 溶劑浸提法

溶劑浸提法屬于傳統(tǒng)的多酚提取方法。常用的溶劑有水、甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液、乙酸乙酯等。根據(jù)相似相溶原理，多酚易溶于這些溶劑，溶劑浸提法還是目前工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法［17］。

該方法提取過程比較簡單，但在生產(chǎn)過程中要用到多種有機(jī)溶劑，且有機(jī)溶劑的用量大;工序多，需多次蒸餾，工藝繁瑣復(fù)雜;加熱時(shí)間過長，多酚易氧化;操作不夠安全。

1．2 金屬離子沉淀法

金屬離子沉淀法是利用多酚能與某些金屬離子絡(luò)合成結(jié)晶性沉淀物的特點(diǎn)，使其從浸提液中分離出來，實(shí)現(xiàn)與其它雜質(zhì)的初步分離。常用的金屬離子有Al3+，Ca2+，F(xiàn)e2+，Mg2+，Zn2+等。其中，Zn2+，Al3+是較適宜的弱酸性沉淀劑［18］。

該方法的特點(diǎn)是經(jīng)熱水浸提后，加入沉淀劑即可得到多酚與金屬離子的結(jié)晶性沉淀物，不必濃縮浸提液，可在一定程度上降低能耗。同時(shí)，由于這些沉淀的選擇性較高，產(chǎn)品的純度相對較好。但在其后的稀酸轉(zhuǎn)溶過程中多酚損失較大，而且沉淀劑有的是有一定毒性的金屬離子，有的偏堿性易造成多酚的氧化。因此，在產(chǎn)品的純度、收率、成本及安全性上仍不能完全令人滿意。另外，由于該方法使用了重金屬作沉淀劑，其產(chǎn)品是食品和醫(yī)藥行業(yè)所不能接受的。

1．3 樹脂吸附法

樹脂吸附法提取多酚是利用樹脂能對多酚發(fā)生吸附—解吸作用的特性來實(shí)現(xiàn)多酚與其它浸提物組分之間的分離。根據(jù)所采用的樹脂類型的不同可分為吸附柱分離法、離子交換柱分離法和凝膠柱分離法;按其極性大小和所選用的單體分子結(jié)構(gòu)不同，可分為非極性大孔吸附樹脂、中等極性大孔吸附樹脂和極性大孔吸附樹脂。徐向群等［19］、董文賓等［20］研究了用大孔吸附樹脂制備茶多酚精品的工藝，得出了最優(yōu)的吸附條件。

利用樹脂吸附法提取多酚，技術(shù)路線簡單，操作方便，能耗較低;操作條件溫和，可避免有效成分的失活，產(chǎn)品收率和純度好。尤其是整個(gè)過程中使用的有機(jī)溶劑主要是乙醇，具有回收容易、無毒等優(yōu)點(diǎn)，而且可連續(xù)性生產(chǎn)，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1．4 微波輔助提取法

微波輔助提取(Microwave-Assisted Extraction)技術(shù)是近年來興起的生物活性物質(zhì)提取技術(shù)，基本原理是利用微波場中分子發(fā)生高頻的運(yùn)動(dòng)，擴(kuò)散速率增大，使多酚等浸提物在微波的輻射作用下快速浸取出來。通常研究提取劑、提取劑濃度、料液比、微波功率、提取時(shí)間等實(shí)驗(yàn)因素對多酚類物質(zhì)提取的影響［21，22］。

利用微波輔助提取所需時(shí)間短，因此大大減少了多酚在高溫下的氧化，提高了產(chǎn)品的品質(zhì)與收率。其具有投資少、設(shè)備簡單、使用范圍廣、重復(fù)性好、操作時(shí)間短、溶劑用量少、效率高且物料受熱均勻等優(yōu)點(diǎn)。從報(bào)道的研究結(jié)果表明，利用微波提取法，多酚的提取率明顯高于回流提取法及超聲波提取法［23，24］。但由于微波的溫度較高，其反應(yīng)比較劇烈，易沸騰，操作要小心。

1．5 超聲波提取法

超聲波提取法利用超聲波的機(jī)械破碎和空化作用，加速多酚等浸提物向溶劑的擴(kuò)散速率，縮短浸提時(shí)間。通常研究浸提劑濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度及提取次數(shù)對多酚提取效果的影響，并運(yùn)用正交試驗(yàn)對多酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化［25，26］。

該方法有操作簡便，儀器設(shè)備便捷，提取效率高，溫度要求低，萃取速度快，萃取完全，適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)。超聲波提取方法優(yōu)于普通的溶劑提取法［27］。但是也存在一些不足，如:超聲波提取通常持續(xù)工作時(shí)間較長，消耗溶劑量大。

1．6 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction)技術(shù)是一種正處于積極開發(fā)階段的新型分離技術(shù)，在較低溫度下，不斷增加氣體的壓力時(shí)，氣體會(huì)轉(zhuǎn)化成液體，當(dāng)溫度增高時(shí)，液體的體積增大，對于某一特定的物質(zhì)而言總存在一個(gè)臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)，高于臨界溫度和臨界壓力后，物質(zhì)不會(huì)成為液體或氣體，這一點(diǎn)就是臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)以上的范圍內(nèi)，物質(zhì)狀態(tài)處于氣體和液體之間，這個(gè)范圍之內(nèi)的流體成為超臨界流體(SF)。從固體或液體中萃取某種高沸點(diǎn)和熱敏性成分、以達(dá)到分離和提純的目的。超臨界流體萃取技術(shù)為多酚的深度開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)［28］。

超臨界流體粘度低、擴(kuò)散性高，具有更高的傳質(zhì)效率，基本可以實(shí)現(xiàn)定量萃取和完全萃取。其選擇分離效果好，提取率高，產(chǎn)物沒有有機(jī)溶劑殘留，有利于熱敏性物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的萃?。?9］。超臨界流體萃取所得多酚的純度很高，這是其它工藝所不能達(dá)到的。超臨界流體萃取以無毒無害的二氧化碳作為超臨界溶劑，特別適合于醫(yī)藥、食品添加劑等產(chǎn)品的提取，可作為通用高效的分離技術(shù)而應(yīng)用。王朝瑾等［30］通過對綠茶茶葉的浸提試驗(yàn)，確定了超臨界二氧化碳萃取茶多酚的最佳工藝條件，并通過與溶劑法萃取茶多酚的比較，確定超臨界二氧化碳萃取茶多酚的可行性。但超臨界萃取法提取多酚尚有一定的技術(shù)障礙，主要表現(xiàn)為一次的提取率很低，分離過程在高壓下進(jìn)行，設(shè)備一次性投入大。

2 多酚總量的測定方法

關(guān)于多酚的測定方法近年來有很多報(bào)道，根據(jù)多酚的結(jié)構(gòu)特性、絡(luò)合性能等理化性質(zhì)，目前應(yīng)用于多酚類化合物的測定方法主要有高錳酸鉀滴定法、光譜分析測定法、色譜分析測定法等。

2．1 高錳酸鉀滴定法

本方法是傳統(tǒng)的測定方法，具有一定的代表性。它是利用多酚類化合物中酚羥基的還原性，以1．0 g/L靛紅溶液為指示劑測定食品中的多酚類物質(zhì)含量。高錳酸鉀是強(qiáng)氧化劑，被測溶液中的還原性物質(zhì)一般均能被氧化，所以用這種方法測定選擇性不高。李思睿等［31］對該方法所使用的各種藥劑性狀及其穩(wěn)定性做了研究，以便在檢測中更合理地使用各種藥劑，減少誤差的產(chǎn)生。

2．2 光譜分析測定法

2．2．1 可見分光光度法 多酚是一類具有多酚羥基的物質(zhì)，在一定條件下可與金屬離子發(fā)生顯色反應(yīng)用于定量。光譜分析測定法多以福林-肖卡(Folin-Ciocalteu)比色法、分光光度法、流動(dòng)注射法和紅外吸收光譜法等分析技術(shù)來測定樣品中多酚的總量。

(1)福林肖卡比色法 此法是我國測定茶多酚的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。作為衡量天然產(chǎn)物中總酚含量的方法［32］，最大吸收峰為765 nm。Folin-Ciocalteu試劑是一種強(qiáng)氧化劑，其還原型為藍(lán)色，多酚的量與藍(lán)色的深淺成正比［33，34］。目前國際上均采用沒食子酸(GA)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［35］，用來定量多酚的含量，是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的重要試劑［36］。福林肖卡在實(shí)際中應(yīng)用較廣［37～39］，如李巨秀、王柏玉［37］以桑椹為原料，沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究了用福林-肖卡比色法測定桑椹提取液中多酚類物質(zhì)含量的最適反應(yīng)條件;李靜等［40］對Folin-Denis法(即福林-酚法，水果及其制品中測定多酚含量的另一種方法)和Folin-Ciocalteus法測定水果及其制品中總多酚含量進(jìn)行了研究。Folin-Ciocalteus法比Folin-Denis法更加穩(wěn)定、靈敏和準(zhǔn)確。并且此法簡單、敏感、精確，對特異性和標(biāo)準(zhǔn)化的測定十分有利，能在一定程度上克服植物性材料中一些限制性和多變性因素，適宜樣品總多酚含量的測定。但其測出的是多酚類化合物相對總量，受多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響較大［41］。故在試驗(yàn)中，應(yīng)對結(jié)果中干擾性物質(zhì)進(jìn)行修正。

(2)酒石酸亞鐵分光光度法 1953年，Roux等建立植物多酚的酒石酸亞鐵545 nm分光光度測定法，其原理是在一定條件下，食品或植物組織中的多酚類物質(zhì)能與酒石酸亞鐵形成藍(lán)紫色絡(luò)合物，絡(luò)合物的吸光度值在一定的濃度范圍內(nèi)與多酚類物質(zhì)的濃度成正比［42］。此后回瑞華等［43］，采用三波長-光譜法消除隨濃度不同發(fā)生的本底漂移及吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，建立了酚類物質(zhì)酒石酸亞鐵分光光度測定法。酒石酸亞鐵分光光度法是多酚類化合物測定中引用最多的快速分析方法，也是我國測定茶多酚的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。

雷昌貴等［44］發(fā)現(xiàn)由于測定方法本身存在的局限性。分光光度法測定多酚含量時(shí)存在吸收峰不對稱給定量帶來的影響，回瑞華等［45］在此基礎(chǔ)上采用三波長分光光度法來彌補(bǔ)吸收峰不對稱這一不足，取得了較好結(jié)果。

(3)其他顯色方法 除了以上幾種顯色反應(yīng)外，還有KFe［Fe(CN)6］法［46］，此方法較適用于食品中微量多酚類化合物的測定。原理是利用多酚類物質(zhì)在堿性條件下能與鐵氨離子生成深紅色絡(luò)合物。鉬酸銨分光光度法，依據(jù)的是多酚類物質(zhì)在酸性條件下與鉬酸銨生成黃色鉬酸酯的顯色反應(yīng)［47］。另外還有多酚在酸性條件下與磷鉬酸銨結(jié)合形成磷鉬酸酯的反應(yīng)等［48］。這些方法各有利弊，在此不再贅述。

2．2．2 原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法測定多酚的含量與可見分光光度法的不同之處在于后者測定的是絡(luò)合體系中絡(luò)合物含量，而前者是多酚與金屬離子的反應(yīng)，然后通過測定絡(luò)合體系上清液金屬離子或剩余的金屬離子量而間接測定之。廖曉玲等［49］采用原子吸收分光光度間接測定法，利用茶多酚與堿式乙酸鉛絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生難溶于水的黃色沉淀，將絡(luò)合體系離心后，用原子吸收法測定上清液中過量的鉛離子，間接測定茶多酚的含量。

原子吸收分光光度法選擇性比高錳酸鉀滴定法要高，但增加了沉淀離心分離步驟，操作比較繁瑣。與Folin-Ciocalteu試劑法相比，本方法更適合于測定食品中的高分子量的多酚類化合物，且干擾要比后者要小。

2．2．3 紅外光譜法 近紅外光譜的波長范圍為780～2 526 nm，其信息主要是分子結(jié)構(gòu)中的C-H，OH，C-O等基團(tuán)的倍頻吸收及其伸縮振動(dòng)、彎曲振動(dòng)的合頻和差頻產(chǎn)生的吸收峰。在特定波長處，不同樣品的吸收值差異反映樣品中酚組分含量的不同［50］，可定量快速檢測總兒茶素在茶多酚中的含量［51，52］。

2．2．4 流動(dòng)注射法 流動(dòng)注射分析法以其高精度、高效率及裝置簡單等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。此方法測定的是還原型多酚的含量，因此對樣品的測定結(jié)果較標(biāo)準(zhǔn)法偏低。余宇燕等［53］建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測定茶飲料中的茶多酚的新方法。

3 多酚的分離及組分含量的測定

測定多酚的多種組分含量，需采用能夠進(jìn)行組分分離的色譜法來定量分析測定。分離后的成分能夠與一定的顯色劑作用，然后比色定量。色譜法是近代分析化學(xué)中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的分離分析技術(shù)。在化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。20世紀(jì)50～60年代紙色譜(PC)和薄層色譜(TLC)開始應(yīng)用于茶多酚的分析。隨著工業(yè)的發(fā)展出現(xiàn)了現(xiàn)在廣泛使用的氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)、超臨界流體色譜(SFC)、毛細(xì)管電泳測定法(HPCE)等［54］。由于這些方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可同時(shí)用于多酚的分離和測定，已廣泛應(yīng)用于商品茶多酚、茶葉或茶飲料、化妝品等實(shí)際樣品的含量測定。

3．1 薄層色譜法(TLC)

薄層色譜法由Stahl于1958年建立，具有設(shè)備簡單、成本低、操作方便、分離速度快、靈敏度及分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為一般實(shí)驗(yàn)室必不可少的分離分析手段［55］。并廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的分離、提取和研究及藥物和毒物的鑒定。通過適當(dāng)?shù)剡x擇吸附劑，既可用于吸附色譜法，也可用于分配色譜法。薄層色譜法的分辨率高于同固定相的柱色譜，為進(jìn)一步進(jìn)行HPLC流動(dòng)相的分析提供依據(jù)。因此，不失為初步定性檢測的一種較理想的方法。缺點(diǎn)是其分離多酚組分不多且定量也不夠準(zhǔn)確。

3．2 氣相色譜法(GC)

氣相色譜法是一種極為有效的分離方法，可以分離、分析復(fù)雜的多組分混合物，但一般用于分離弱極性、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性高的有機(jī)物。高效能的色譜柱、高靈敏度的檢測器以及計(jì)算機(jī)處理技術(shù)，使其在食品工業(yè)、生物技術(shù)、農(nóng)副產(chǎn)品等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。但植物多酚是強(qiáng)極性、不易揮發(fā)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)物，分子量在500～3 000 u之間，分子量越高，熱穩(wěn)定性越弱。為了降低植物多酚的極性和提高揮發(fā)性，常常需要加入硅烷化試劑使其衍生化。

3．3 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法(HPLC)于1960年后期開始應(yīng)用。是色譜法中的一個(gè)重要分支，據(jù)估計(jì)，自然界70%以上的化合物均可用這種方法分析。試驗(yàn)中確定色譜條件包括:色譜柱的確定，適宜的固定相為未修飾的C18填料，如Spherisorb ODS1;檢測波長的確定;流動(dòng)相及比例的確定，洗脫溶劑為水-甲醇/乙醇、水-乙腈體系，通常加入乙酸或磷酸鹽緩沖液來抑制羧基和酚羥基的電離;流速對分離度的影響;溫度對分離度的影響;進(jìn)樣量等［56，57］。

目前，高效液相色譜法是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛、最有效的分離分析技術(shù)之一，具有分辨率高、分析速度快、重復(fù)性好、定量分析精確度高等優(yōu)點(diǎn)，并可用作實(shí)驗(yàn)室小量色譜純樣品的制備，所以發(fā)展特別迅速。在短短的幾年時(shí)間內(nèi)，已被廣泛應(yīng)用于食品中多酚類化合物等非揮發(fā)性成分的分離鑒定。

高速逆流譜［58］、高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光法及多種儀器聯(lián)用新方法的建立［59］，將進(jìn)一步提高酚酸檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。高速逆流色譜作為一種不需要固態(tài)載體的液-液分配色譜，現(xiàn)已在天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)柱層析法相比，它具有分離速度快、樣品吸附低、分離重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)［60］。KumarN S［61］以正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水為溶劑，通過高速逆流色譜分離茶葉提取物中的7種兒茶素，EGCG，ECG與EGC的純度可達(dá)91% ～99%。

3．4 超臨界流體色譜(SFC)

SFC一般用CO2做流動(dòng)相，既可分析GC難以處理的高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定的樣品，又比HPLC的柱效高、分析時(shí)間短。SFC可以使用GC和LC檢測器，也可與MS-IR等在線聯(lián)接，進(jìn)行簡便、快速的定性定量分析。但是由于流動(dòng)相較貴，該技術(shù)適宜于萃取高價(jià)值的油脂(包括天然功能性油脂)、精油、內(nèi)酯等極性較低的天然產(chǎn)物有效成分，應(yīng)用受到限制。

3．5 毛細(xì)管電泳測定法(HPCE)

毛細(xì)管電泳測定法(HPCE)是測定多酚含量的電化學(xué)分析方法，是指溶質(zhì)以電場為推動(dòng)力，在毛細(xì)管中按淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)的高效快速分離的新技術(shù)［57］。HPCE是近十幾年來發(fā)展很快的一種高效分離技術(shù)，具有靈敏、高效、快速、進(jìn)樣體積小、成本低，溶劑消耗少和抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)。而且與HPLC法相比溶劑無毒性。

毛細(xì)管電泳方法是一種連續(xù)快速分離茶葉中兒茶素組分的新方法，可在8 min內(nèi)完成一個(gè)樣品全分離，進(jìn)樣量少、無環(huán)境污染問題。魏泱等［62］報(bào)道，在采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析綠茶時(shí)，高壓液相法在準(zhǔn)確性和靈敏性方面比毛細(xì)管區(qū)帶電泳法更有優(yōu)勢，而且高壓液相法可用于樣品的制備和半制備;但毛細(xì)管區(qū)帶電泳法的分離效率更高，可解決反相高壓液相法分離多酚化合物出現(xiàn)的峰展寬現(xiàn)象，而且由于所需樣品少，分析速度快，在樣品分析中更具有實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性。

4 結(jié) 語

近年來，國內(nèi)對植物多酚的研究比較活躍，如何充分、合理、科學(xué)地利用我國豐富的植物多酚這一綠色資源已經(jīng)成為一項(xiàng)重要課題。在提取方面，傳統(tǒng)的溶劑提取法及沉淀分離方法制備多酚，產(chǎn)品在顏色、純度和溶劑殘留等方面不能滿足國內(nèi)外用戶日益提高的要求，尤其是在工藝中使用大量易燃易爆的有機(jī)溶劑，有的甚至使用有毒的氯仿，金屬離子等溶劑，致使安全性差，質(zhì)量差，綜合成本高。微波、超聲波萃取技術(shù)和超臨界流體萃取技術(shù)具有提取率高、產(chǎn)品純度好、流程簡單、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，正在得到廣泛應(yīng)用。在總量測定方面，雖然有很多方法提出，但其操作過程還不夠成熟，在摸索過程中，應(yīng)用較多的還是經(jīng)典的可見分光光度法。在分離測定方法中，高效液相色譜法已經(jīng)逐步代替薄層色譜法，其具有分辨率高、分析速度快、定量分析精確度高等優(yōu)點(diǎn)，是正在崛起的方法，得到了廣泛的應(yīng)用。隨著科學(xué)的發(fā)展，我們應(yīng)該在改進(jìn)傳統(tǒng)經(jīng)典方法的基礎(chǔ)上，廣泛地開發(fā)和應(yīng)用新技術(shù)。這樣既可生產(chǎn)出高質(zhì)量的多酚，又可解決傳統(tǒng)工藝的一些弊端，將會(huì)有很好的發(fā)展前景。

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