自體骨髓干細胞移植治療肝硬化研究進展

劉衛(wèi) 朱斌

肝臟是人體重要的消化器官，具有強大的物質代謝、合成、生物轉化等功能。各種原因導致的終末期肝病患者內科治療療效欠佳，病情常不能逆轉，病死率高。晚期肝病的治療已經(jīng)成為整個世界范圍內的醫(yī)學難題，現(xiàn)在治療終末期肝病最有效的手段是肝移植。但肝移植費用昂貴，加之供肝來源緊張，于是人們把更多的注意力轉到了再生醫(yī)學上，即通過干細胞移植治療，以求恢復肝臟的物質代謝功能。經(jīng)過多年對干細胞的研究，骨髓干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）移植已經(jīng)在國內外得到廣泛應用。近年來對自體骨髓干細胞移植治療肝硬化的研究也逐漸深入。經(jīng)過動物模型及臨床研究，已經(jīng)證實其治療的有效性，并且此方法還具有操作簡單、創(chuàng)傷小、不存在排斥反應、并發(fā)癥少、費用低等優(yōu)點。本文就自體骨髓干細胞移植治療肝硬化的研究進展作一綜述。

一、干細胞的生物學特性

干細胞是指未經(jīng)分化的、具有自我更新能力及能分化為多種細胞系的潛能細胞，分為胚胎干細胞和成體干細胞，在成體的組織和器官中存在多種干細胞：如BMSC、肝干細胞、脂肪源性干細胞、外周血干細胞等。BMSC最早由Friedenstein等于1966年發(fā)現(xiàn)。此后，不同的研究小組對骨髓來源的并與BMSCs相似的干細胞進行了一系列的研究，并賦予其不同的稱謂：如骨髓間質狀干細胞（bone marrow stromal stem cell，BMSSC）、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）、成人骨髓多分化誘導細胞（marrow-isolated adult multipotent inducible cells，MIAMI）、成人多分化祖細胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC）、成人間充質干細胞（mesenchymal adult stem cells，MASCS）等[1～3]。這些研究均證實了MSCs類細胞具備多向分化潛能。雖MSCs不能無限增殖，但在良好的培養(yǎng)環(huán)境下可擴增許多倍后仍能保持增殖能力及具有多向分化潛能。MSCs能分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、心肌細胞、成纖維細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、非中胚層的胰島細胞和肝細胞等[4，5]。

二、干細胞與肝臟

1999年，Petersen等[6]報道了肝細胞具有骨髓源性。骨髓干細胞分為造血干細胞（hemopoietic stem cells，HSCs）和MSCs。一些學者提出骨髓間充質干細胞是最有效的肝細胞分化來源細胞[7]。BMSCs向某種細胞系分化取決于培養(yǎng)環(huán)境，尤其依賴于生長因子的誘導。一些化學藥物亦能影響B(tài)MSCs的分化方向，如將BMSCs與地塞米松、胰島素、異丁基黃嘌呤及吲哚美辛等混合培養(yǎng)后，能向脂肪細胞分化。BMSCs向肝細胞分化亦是一個較為復雜的過程。Sarah等[8]對健康成人獲取的MSCs進行培養(yǎng)，加入20ng/mL的EGF、10ng/mL的FGF、20ng/mL的肝細胞生長因子（HGF）、20ng/mL的綿羊頜下黏液蛋白、地塞米松、煙酰胺及苯磺酸等物質后，同樣能獲得成熟的肝細胞，且分化而來的肝細胞具備完整的功能。有關研究證實，在肝臟的微環(huán)境中，干細胞能夠分化為有功能的肝細胞并增殖。Petersen等[6]通過動物實驗證實了小鼠骨髓干細胞可以分化為肝細胞和膽管細胞。Okumoto等[9]用含有細胞外基質并加入高濃度的HGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs分化為肝細胞系并增殖，并能表達白蛋白。以上研究表明，干細胞具有分化為成熟肝細胞的潛能，在適宜的微環(huán)境中，干細胞能被誘導分化為肝細胞，并表達成熟肝細胞的特異性因子。

研究表明，骨髓干細胞不僅能通過再生肝細胞來部分恢復肝細胞代謝功能，還能分泌基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），特別是 MMP-9，降解肝臟間質纖維組織來改善肝臟纖維化和肝硬化[10，11]。陳國忠等[12]發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞與肝星狀細胞共培養(yǎng)能抑制星狀細胞增值及促進其凋亡。

三、骨髓干細胞的提取和分離

骨髓干細胞的分離是臨床治療的第一步。獲取高質量的供體細胞是關鍵，有時甚至直接影響治療效果。

骨髓干細胞分離方法較多，常用的干細胞分離方法有：貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分離法等。臨床上較為常用的是Oh SH[13]及Wollert[14]等報道的密度梯度離心法。該法較為簡便，實用性強，適合臨床使用：在層流無菌治療室內，選患者雙側髂后上棘為采髓點，常規(guī)消毒鋪巾局麻后，18號骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓 65～95ml左右，以4000U肝素抗凝，避免污染。離心去除脂肪層，用等量DMEM培養(yǎng)液稀釋骨髓，制成細胞懸液。輕輕加到密度1.073/ml的Percoll分離液上，室溫下以1200rpm離心25min。吸取界面細胞層，用生理鹽水洗脫，1500rpm離心5min×3次。生理鹽水重懸細胞，鏡下計數(shù)。

四、治療

目前，臨床常用的有同種異體骨髓干細胞移植及自體骨髓干細胞移植，但同種異體骨髓干細胞移植面臨著缺乏供體細胞、移植細胞被排斥等問題，而自體骨髓干細胞移植則很好地解決了這些矛盾。

骨髓干細胞肝臟移植的方法包括：經(jīng)門靜脈移植、經(jīng)股動脈移植、脾內移植、外周靜脈移植、肝內移植、腹腔移植等。門靜脈移植：分為經(jīng)皮肝內門靜脈移植和剖腹腸系膜靜脈或借助腹腔鏡門靜脈移植兩種方式。后一種方式創(chuàng)傷較大，較少應用。經(jīng)皮肝內門靜脈移植方法的技術成熟，且創(chuàng)傷相對較小。通過門靜脈移植BMSCs的方法符合肝臟組織學及生理學特點，細胞更易進入肝竇中[15]。經(jīng)股動脈介入移植：在X線監(jiān)視下，經(jīng)股動脈穿刺，將分離的骨髓干細胞通過導管從肝動脈緩慢注入到病肝內，之后用10 mL生理鹽水沖洗管腔，注射速度為1 mL/min[16～18]。由于介入治療的廣泛開展，對其技術掌握也很熟練，此方法在骨髓干細胞移植中應用較多。腹腔移植：此方法創(chuàng)傷較小，且可移植較大數(shù)量的干細胞，但其缺點是干細胞在腹腔內較難存活。Liu等[19]用生物包裹的BMSCs移植到90%肝臟被切除的同種異體小鼠腹腔，小鼠的肝功能改善，生存率明顯提高。外周靜脈移植：Terai等[14]對9例肝硬化患者通過外周靜脈將5.20±0.63×109單個核細胞注入體內，細胞的存活率超過了90%，術后肝功能改善明顯。脾內移植：將干細胞注入脾內，干細胞從脾臟通過門靜脈緩慢進入肝實質，可以避免從門靜脈直接注射引起栓塞的可能。Ju等[20]將大約6×106個骨髓間充質干細胞注入肝硬化小鼠脾內，3小時后在小鼠肝內檢測到骨髓干細胞。

姚鵬等[16]對20例慢性肝衰竭患者進行自體骨髓干細胞移植治療，未發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，術后有輕度惡心1例，發(fā)熱1例；在移植8周后，患者丙氨酸轉氨酶、總膽紅素、直接膽紅素均逐漸降低，白蛋白逐漸升高，凝血酶原活動度逐漸上升；張強[21]等的研究表明，移植后大多數(shù)患者癥狀明顯改善，腹水減少，食欲改善，體力好轉，睡眠改善。其中3例肝硬化Child-Pugh C級患者取得了較好的療效，提示肝臟損害嚴重的肝硬化患者肝內移植骨髓干細胞仍然可以獲得較好的效果。Khan等[22]選擇4例肝硬化患者，在自體骨髓干細胞移植治療術后6個月的隨訪中，3例患者血清白蛋白升高、1例無變化。Terai等[17]報道在9例肝硬化患者，采用自體骨髓干細胞外周靜脈注射到患者體內，術后第一天9例患者均出現(xiàn)發(fā)熱（約38℃），無其他副反應。移植24周后觀察發(fā)現(xiàn)所有患者血清白蛋白、總蛋白及Child-Pugh評分均有顯著提高。Levicar等選擇5例慢性肝病患者，通過門靜脈（3例）及肝動脈（2例）將自體骨髓干細胞移植到肝臟內，移植細胞數(shù)量為1×106至2×108之間，連續(xù)隨訪12～18個月顯示所有接受細胞移植的患者均較好的耐受了移植治療，其中4例患者白蛋白增加并一直保持不變，所有患者甲胎蛋白均保持在正常范圍內，未見肝臟腫瘤及局部肝損害發(fā)生，未見嚴重的并發(fā)癥和副反應發(fā)生[23]。最近，郭曉鐘等報道，對78例肝硬化患者行自體骨髓干細胞移植治療，在移植4周后，患者丙氨酸轉氨酶明顯降低，白蛋白、PTA明顯上升、Child-Pugh評分顯著提高，腹水明顯減少或消失，乏力納差改善[24]。

通過目前的臨床觀察，干細胞移植治療肝硬化已經(jīng)表現(xiàn)出了明顯的治療效果，肝功能得到改善，減少了患者的痛苦，改善了生活質量，提高了生存率，并且未出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥和副反應。

五、自體骨髓干細胞移植治療肝硬化的相關問題

在各種病理條件的微環(huán)境下，干細胞向各種組織細胞分化的機制還不清楚，在移植干細胞后，會不會引起腫瘤細胞的分化和增殖，還需要通過長期的實驗和臨床來證實。目前，自體骨髓干細胞移植治療肝硬化開展的時間才三年多，患者的遠期療效及是否有其他并發(fā)癥還有待觀察。對于干細胞移植治療的適應證、禁忌證、移植途徑的選擇、移植干細胞的數(shù)量、移植次數(shù)等還沒有相關的標準，還需要不斷的完善和規(guī)范。

六、展望

二十一世紀將會是細胞治療的時代，干細胞移植治療肝硬化的諸多優(yōu)點，使得它非常適合我國的國情。我國的干細胞臨床治療起步早，開展范圍廣，有較好的臨床經(jīng)驗，取得了較好的效果，為我們的干細胞研究奠定了一個非常好的基礎。同時，干細胞移植也為我們在某些重癥疾病的治療上帶來了希望，是我們以后基礎研究和臨床治療發(fā)展最前沿的方向。

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