斑馬魚在環(huán)境檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用

劉在平,張松林

(西北師范大學地理與環(huán)境科學學院,甘肅 蘭州 730070)

·監(jiān)測技術(shù)·

斑馬魚在環(huán)境檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用

劉在平,張松林

(西北師范大學地理與環(huán)境科學學院,甘肅 蘭州 730070)

斑馬魚易飼養(yǎng)、易管理,體外受精和體外發(fā)育,可常年產(chǎn)卵、孵化,因此早期被作為模型動物廣泛用于生物學研究中。近年來,隨著環(huán)境問題日益突出,迫切需要有效、全面的環(huán)境監(jiān)測手段和方法。斑馬魚或其轉(zhuǎn)基因品種就是非常好的環(huán)境監(jiān)測首選生物。因其對許多環(huán)境污染物十分敏感,可實時檢測進入水環(huán)境的污染物。對斑馬魚在水體中重金屬毒性、環(huán)境激素、綜合毒性、生物誘導和有機污染物毒性檢測等方面的應(yīng)用進行了初步討論,以期為相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

斑馬魚;環(huán)境檢測;應(yīng)用;毒性檢測;環(huán)境激素;生物誘導

0 引言

斑馬魚 (Danio rerio),又名斑馬擔尼魚、藍條魚、花條魚、印度魚、印度斑馬魚、藍斑馬魚和黑斑刺鲃魚等,屬于輻鰭亞綱 (Actinopterygii)鯉科 (Cyprinidae)短擔尼魚屬 (Danio)的一種硬骨魚。原產(chǎn)于印度東部、巴基斯坦、緬甸以及孟加拉國的小溪、稻田及恒河中游地區(qū),是一種小型熱帶魚。

斑馬魚在環(huán)境科學研究中之所以備受關(guān)注,是因為它是世界公認的新興模式動物。與其他模式脊椎動物相比,有其獨特優(yōu)勢:成魚體型小、易管理、養(yǎng)殖成本低;體外受精、體外發(fā)育、早期發(fā)育快;其對污染物的作用反應(yīng)快,可在短時間內(nèi)調(diào)查水污染狀況或用于特定污染物的檢測等;可用于建立毒理學評價模型;其基因組計劃已基本完成,已知基因較多,廣泛用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因活性抑制技術(shù)等;品系資源豐富,研究中常用的斑馬魚野生型品系主要為 Tuebingen品系、AB品系和W IK品系等。另外,保存有 3 000多個突變品系和 100多個轉(zhuǎn)基因品系,這些品系對利用斑馬魚開展各種科學研究均有很大的推動作用。

1 斑馬魚在環(huán)境檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用

近年來,國內(nèi)外開始運用斑馬魚或轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行水體中重金屬毒性、環(huán)境激素、綜合毒性、生物誘導劑和有機污染物毒性檢測等,成效顯著,因而備受關(guān)注。

1.1 在重金屬毒性檢測中的應(yīng)用

重金屬對生物的脅迫效應(yīng)已有報道。李淑瓊等用斑馬魚獲得了 Zn2+、Cr6+、Cd2+作用下的毒性效應(yīng)情況:重金屬單一毒性表明,在投加毒物后幾小時內(nèi),斑馬魚的行為一般都會有特殊的變化,如行動變緩、呼吸變慢等。當接觸 Cd2+時表現(xiàn)出異常的興奮狀態(tài),接近死亡前行動會變快,四處亂竄。Zn2+、Cr6+、Cd2+的 24 h半致死質(zhì)量濃度(LC50)分別是 25.88,46.20和 1.04 mg/L。對斑馬魚的毒性排列為 Cd2+>Zn2+>Cr6+,其中 Cd2+為劇毒,Zn2+、Cr6+為高毒;聯(lián)合毒性研究發(fā)現(xiàn),Zn2+、Cr6+、Cd2+為協(xié)同作用,Cr6+的影響較顯著[1]。劉大勝等也進行了相似研究:4種金屬離子對斑馬魚的毒性大小依次為:Cu2+>Cd2+>Zn2+>Cr6+[2]。修瑞琴等進行的聯(lián)合毒性實驗結(jié)果為:As3+與 Cd2+,以及 As3+與 Zn2+共存時的聯(lián)合毒性均為拮抗作用,而 Cd2+與 Zn2+的聯(lián)合毒性主要為毒性劇增的協(xié)同作用。但當 As3+、Cd2+、Zn2+3種毒物聯(lián)合時其毒性則為拮抗作用[3]?？梢?多種毒物共同污染環(huán)境后,發(fā)生了復雜的聯(lián)合毒性效應(yīng)。這是在以后研究中需要注意的方面,盡量避免從單一毒物的含量去判斷污染后的毒性危害。重金屬 Pb、Zn對斑馬魚也有毒性效應(yīng),對其 24 h的LC50分別為 5.38和 3.99mg/L[4]。

此外,金屬對斑馬魚胚胎的毒性影響也很明顯。陳中智等用 Ca2+與 Pb2+測試了斑馬魚胚胎,結(jié)果表明:Pb暴露的高濃度組與對照相比,胚胎的孵化率有明顯的降低,這可能是 Pb對其發(fā)育過程有影響。有些延遲孵化的個體在觀察的時間內(nèi)發(fā)育不完全,能夠孵化的個體也多出現(xiàn)畸形、平衡能力及游泳能力降低等現(xiàn)象。當 Ca2+濃度從 0.25 mmol/L增加到 2.00 mmol/L時,導致了 72 h EC50{Pb2+}(游離鉛離子濃度)和 72 h EC50[Pb]T(溶解態(tài)鉛總濃度)的升高,表現(xiàn)為胚胎延遲孵化及孵化率降低[5]。

1.2 在環(huán)境激素檢測中的應(yīng)用

環(huán)境雌激素會影響生物的生殖、發(fā)育以及內(nèi)分泌、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)等,有的還有致癌作用[6,7]。其結(jié)構(gòu)多樣,且有新的環(huán)境激素不斷出現(xiàn),單從分子結(jié)構(gòu)很難預(yù)測其干擾能力,因此需要新的檢測技術(shù)。

有實驗證實斑馬魚可成為檢測環(huán)境激素的模型生物。斑馬魚暴露于濃度相對較低的環(huán)境激素后,在其性腺發(fā)育過程中就會出現(xiàn)干擾和反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。如將斑馬魚暴露在低于1 ng/L的17α-乙炔雌二醇 (EE2)水溶液中,就會出現(xiàn)性別比例變化[8]。OLSSON等和 K IME等將成年雌性斑馬魚暴露在17β-雌二醇 (E2)和 EE2中,發(fā)現(xiàn)其胚胎發(fā)育受到抑制[9,10]。另外,斑馬魚暴露在一些多氯聯(lián)苯(PCBs)及其代謝物和鄰苯二甲酸 (2-乙基己基酯)(DEHP)等雌激素類化合物中,也發(fā)生了類似的現(xiàn)象[11]。

還有研究表明,成年斑馬魚的鄰苯二甲酸二丁酯 (DBP)暴露會明顯抑制 F1代雄魚的性腺發(fā)育,引起生精小管畸形,且精巢間質(zhì) (Leydig)細胞廣泛而明顯的增生與精子數(shù)量減少同時存在的特征十分明確[12]。黃菲等將性成熟的斑馬魚分別暴露于菲 (PHE)中,當ρ(PHE)>0.05μg/L時能夠顯著降低斑馬魚的產(chǎn)卵量和受精率。ρ(PHE)>50μg/L時則會抑制受精卵的孵化[13]?？梢?一定量的環(huán)境激素對生物的危害是相當嚴重的,有必要控制其應(yīng)用范圍和使用量。

1.3 在綜合毒性檢測中的應(yīng)用

對水質(zhì)進行全面檢測以了解其污染狀況和可能危害是解決水污染問題的前提。利用水污染的“活檢測器”——斑馬魚檢測水質(zhì)變化,能夠更加快速、真實和直觀地反映水污染狀況[14]。

潘力軍等檢測了被農(nóng)藥污染的飲用水和地表水源水,發(fā)現(xiàn)斑馬魚對兩種農(nóng)藥具有較高的靈敏性,最低可達微克級,而且速度快[15]。隨后他們又用斑馬魚對幾家鄉(xiāng)鎮(zhèn)皮革廠經(jīng)過簡單沉淀池處理的綜合廢水和某小區(qū)生活污水進行了檢測。結(jié)果表明,斑馬魚可靈敏、快速地檢測工業(yè)廢水和生活污水的毒性[16]。還有學者觀察了不同濃度的城市生活污水對斑馬魚的發(fā)育影響,發(fā)現(xiàn)在早期生命階段,高濃度的生活污水對斑馬魚有致畸、致死效應(yīng)。原因主要是污水中含有不少有機污染物、大量的細茵、病毒、部分寄生蟲卵以及化學有害物[17]。

轉(zhuǎn)基因斑馬魚對水體污染物更敏感,一旦微量的有毒有害物質(zhì)進入水源就會立刻產(chǎn)生反應(yīng)。孫國根報道了一些研究者成功培育了一種可檢測水環(huán)境中雌激素污染的 F1代轉(zhuǎn)基因斑馬魚,它能直觀、靈敏、特異和快速地顯示水環(huán)境中雌激素類污染,即便極微量,其肝臟也會發(fā)出綠色熒光[18]。CARVAN等人運用轉(zhuǎn)基因斑馬魚的一些效應(yīng)元件來檢測某些污染物。當這些效應(yīng)元件遇到其敏感的污染物時,就會被激活而發(fā)出綠光或紅光,以提示水中存在特定的有毒有害物質(zhì)[19]。

1.4 在生物誘導檢測中的應(yīng)用

采用斑馬魚誘導效應(yīng)確定環(huán)境污染物的報道較少。何秋霞等用腺苷二磷酸 (ADP)誘導斑馬魚血小板,發(fā)現(xiàn)ADP能使斑馬仔魚血小板在其眼睛、背部等多處聚集,一定條件時可導致其死亡[20]。用 N-乙基-N-亞硝基脲 (ENU)誘導斑馬魚,使其早期產(chǎn)生脊椎形態(tài)異常、體節(jié)減少、心臟血液系統(tǒng)異常、鰓弓及腭發(fā)育異常、腦和神經(jīng)系統(tǒng)退化、魚鰭發(fā)育不全和魚鰾缺失等現(xiàn)象,其中以脊柱和體節(jié)異常為主[21]。可見,斑馬魚也是生物誘導劑的敏感生物,可有效檢測水環(huán)境中的生物誘導劑。

1.5 在有機污染物毒性檢測中的應(yīng)用

隨著環(huán)保要求日益嚴格,生產(chǎn)、應(yīng)用或排放有機污染化學物質(zhì)時需要詳細了解其毒性數(shù)據(jù),而斑馬魚則是最佳檢測動物模型之一。

王宇等測定了倍硫磷、氨磺磷、氯硫磷、殺螟松、碘硫磷、皮蠅硫磷、異氯磷、甲基對硫磷和乙基溴硫磷等 9種硫代磷酸酯類化合物對斑馬魚的急性毒性 96h的 LC50值,分別為 0.95,4.52,1.95,3.03,0.85,0.56,3.44,3.44和 0.82 mg/L。其中倍硫磷、碘硫磷、皮蠅硫磷和乙基溴硫磷屬于劇毒,其他 5種屬于高毒。影響這些有機物毒性的主要結(jié)構(gòu)因素是 2個MEDV(分子電性距離矢量)描述子表達的 3個子結(jié)構(gòu)碎片,即—CH3、—cCc和≥N=。其中子結(jié)構(gòu)—CH3、— cCc與硫代磷酸酯類化合物母體骨架密切相關(guān),而≥N=則反映取代基的變化[22]。趙于丁等測定了 10種農(nóng)藥對斑馬魚的毒性,并根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分,評價了 10種農(nóng)藥對魚類的安全性。結(jié)果表明:有 2種藥劑的96 h LC50<0.1mg/L,屬于劇毒級;5種藥劑的 96 h LC50為 0.1～1.0 mg/L,屬于高毒級;1種藥劑的96 h LC50位于 1.0～10 mg/L,屬于中毒級;2種藥劑的 96 h LC50>10 mg/L,屬于低毒級[23]。無獨有偶,趙春青等采用半靜態(tài)法在室內(nèi)測定了其他 10種不同類型農(nóng)藥對斑馬魚的毒性。根據(jù) 96 h的LC50值,25%氟蟲腈懸浮劑和 8%精喹禾靈微乳劑對斑馬魚高毒;10%吡唑草胺乳油、5%己唑醇懸浮劑、40%乙草胺可濕性粉劑、30%三環(huán)異稻可濕性粉劑和 65%噻嗪酮可濕性粉劑對斑馬魚的毒性中等;25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑、300 g/L雙酰草胺乳油和 35%吡·異可濕性粉劑對斑馬魚低毒。由此可見,斑馬魚作為模式生物,可有效地應(yīng)用于環(huán)境污染物的毒性檢測[24]。

此外,也可從分子水平指標測定污染物對生物的影響。如 2,3,7,8-四氯代二苯并二英(TCDD)和 3,3′,4,4′-四氯聯(lián)苯 (PCB77)均會使斑馬魚肝臟超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性下降,且均對斑馬魚脂質(zhì)有過氧化作用[25]。

2 展望

藥物研制使用的高生產(chǎn)量斑馬魚正在開發(fā)當中,斑馬魚胚胎和魚苗在第一周期間的生存能力決定了此開發(fā)對發(fā)現(xiàn)理想藥物有意義。大多數(shù)親水及親脂性物質(zhì)很容易被培養(yǎng)基卵或魚苗吸收,有效地促進了此測試新的發(fā)展。該領(lǐng)域的斑馬魚毒理病理促進了哺乳動物的毒理病理學的發(fā)展。需要為自發(fā)的和毒物誘導的瘤樣病變和由非腫瘤引起的病變建立一個全面的數(shù)據(jù)庫,把它們的共同點和突變系機理記錄下來。對自然老化病變的各種斑馬魚,需要通過廣泛深入的調(diào)查研究獲取數(shù)據(jù)。利用代謝和藥物動力學來研究毒物在各個共通系和突變系是至關(guān)重要的,它能支持復雜的病理毒理學研究。這方面的資料很少,可對DNA修復酶的各機理展開研究。在未來年份中一旦全部破譯了斑馬魚的基因組序列,將會加快鑒定學研究和DNA修復酶研究的進程。一些科學家在解剖學、組織學、病理學和魚類 (包括斑馬魚)中開展充分的研究,以增加為人類疾病而研究的病理學專業(yè)知識[26]。

斑馬魚基因與人類基因的相似度很高,意味著斑馬魚毒性實驗結(jié)果多數(shù)情況下也適用于人體環(huán)境,因此斑馬魚環(huán)境檢測受到環(huán)境科學研究和環(huán)境保護工作者的重視。此外,斑馬魚胚胎透明,在28.5℃時 24 h內(nèi)就可發(fā)育成形,易觀察水環(huán)境污染物對其發(fā)育過程的影響,且雌性斑馬魚一次可產(chǎn)卵數(shù)百、上千枚,使環(huán)境科學工作者可在同一代魚身上進行不同的實驗研究和監(jiān)測工作,解決環(huán)境生物檢測時標準受試生物材料獲取難、成本昂貴、檢測周期長的問題。

綜上所述,斑馬魚的獨特性質(zhì)決定了其在環(huán)境科學方面的廣泛應(yīng)用前景,尤其是生物技術(shù)的發(fā)展,推動了生物“環(huán)保哨兵”的創(chuàng)建。利用斑馬魚及其轉(zhuǎn)基因品種對環(huán)境污染物進行直觀、快速的預(yù)警檢測預(yù)示其環(huán)境科學應(yīng)用高潮即將到來。另外,斑馬魚在污染生態(tài)毒理學上的研究,是環(huán)境科學的學科生長點,屬于環(huán)境化學學科的新分支學科之一。環(huán)境污染的修復,有賴于污染生態(tài)毒理學的研究,對區(qū)域或國家層面上的生態(tài)安全具有重要意義。相信隨著研究工作的不斷深入,其在環(huán)境科學等領(lǐng)域中將會發(fā)揮更大的作用。

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Application of Zebrafish in the Field of EnvironmentalDetection

L IU Zai-ping,ZHANG Song-lin
(College of Geography and Environment Science,NorthwestNor malUniversity,Lanzhou,Gansu 730070,China)

Zebrafish was raised and managed easily,fertilized and developed in vitro,and layed eggs and hatched throughout the year,such being used widely in biology study as animalmodel.In recent years,alongwith the water environment problem,it needed urgently effective and comprehensive environmentalmonitoringmethods.Zebrafish or geneticallymodified Zebrafish were the best choice ofwater environmentmonitoring.Theywere more sensitive to environmental pollutants,and detected real-t imely environmental pollutants in water.Therefore,the application of zebrafish in heavy metal toxicity,environmental hormone testing,water quality inspection,biological exutory testing,and organic pollutant toxicity was discussed preliminarily,so as to provide reference for relevant research and application.

Zebrafish(Danino rero);environmental detection;application;toxicity test;environmental hormone;biological induction

X835

A

1674-6732(2011)-01-0017-04

10.3969/j.issn.1674-6732.2011.01.005

2010-08-21

甘肅省自然科學基金項目 (2007GS.3614),甘肅省教育廳基金項目 (0801-08)。

劉在平(1977—),男,碩士在讀,從事環(huán)境化學研究工作。