高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應用

唐學紅，肖先舉

（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院， 江蘇 徐州 221140）

分析測試

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應用

唐學紅，肖先舉

（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院， 江蘇 徐州 221140）

介紹了近年來高效液相色譜-質(zhì)譜接口技術(shù)的研究進展，綜述了該技術(shù)在中藥指紋圖譜研究、藥物代謝分析、藥物中非法添加化學藥物成分的鑒定分析、以及殘留藥物成分的鑒定分析方面的應用。隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷完善、發(fā)展，其必將在藥物分析中發(fā)揮越來越重要的作用。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；接口技術(shù)；藥物分析

高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)是將高效液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)成為一個整機使用的檢測技術(shù)。該技術(shù)自20世紀70年代進行開創(chuàng)研究以來，經(jīng)歷了長期的實踐和研究過程，直到90年代大氣壓電離技術(shù)成熟后，各種商品化儀器相繼問世，液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)才得以迅速發(fā)展，成為科研和日常分析的有力工具。HPLC可以直接分離不揮發(fā)性化合物、極性化合物和大分子化合物（包括蛋白質(zhì)、多肽、多糖和多聚物等）；MS靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，可得到更多的化合物的結(jié)構(gòu)信息。HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合HPLC的高分離能力和MS的強定性能力，在生物、藥物、臨床醫(yī)學、化工和環(huán)境等領(lǐng)域應用越來越廣泛。

本文就近年來 HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在中藥指紋圖譜研究、藥物代謝分析、藥物中非法添加化學藥物成分的鑒定分析、以及殘留藥物成分的鑒定分析4個方面的應用作一綜述。

1 HPLC-MS聯(lián)用接口技術(shù)

液質(zhì)聯(lián)用儀是由HPLC、接口裝置及MS三大結(jié)構(gòu)單元組成。由于MS的正常工作需要高真空環(huán)境，而常規(guī)HPLC分析在常溫常壓下就可進行。如果要實現(xiàn)高效液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用，HPLC與MS的連接，即接口技術(shù)是關(guān)鍵。理想的“接口”裝置必須能夠使來自HPLC的連續(xù)流動的液體迅速氣化，在保證MS高真空工作環(huán)境的前提下，去除流動相中的基質(zhì)對質(zhì)譜可能造成的污染，使待測樣品電離成帶電離子，然后進入質(zhì)量分析器被分析。

在液質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)發(fā)展過程中，出現(xiàn)了20多種接口，這些接口都有自己的開發(fā)、完善過程，都有自己的優(yōu)點和缺點。采用過的接口主要有熱噴霧接口（TSP）、粒子束接口（LINIC）、快原子轟擊接口（FAB）、大氣壓離子化接口（API）等。大氣壓離子化接口（API）是當前應用最廣泛的接口技術(shù)，它是一種常壓電離技術(shù)，不需要真空，減少了許多設(shè)備，使用方便，近年來得到了迅速的發(fā)展。大氣壓電離的出現(xiàn)，成功地解決了在大氣壓條件下，使待測物質(zhì)電離并有效的到達質(zhì)譜進行分析，從而解決了接口問題，使液相色譜和質(zhì)譜實現(xiàn)了真正的聯(lián)用。API主要包括三種操作模式：電噴霧離子化（ESI）、離子噴霧離子化（ISI）和大氣壓化學離子化（APCI）。這三種模式中樣品的離子化均是在大氣壓下的離子化室內(nèi)完成，離子化效率高，穩(wěn)定性好，靈敏度高[1]。

2 HPLC-MS技術(shù)在藥物分析中的應用

2.1 在中藥指紋圖譜研究的應用

中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖，它是一種綜合的，可量化的鑒定手段。中藥成分復雜，其中含有大量的次生代謝產(chǎn)物，因此分離提純難度大。目前中藥質(zhì)量控制主要是對一些主要成分或特征性成分進行定性鑒別及含量測定，但大量研究表明，中藥的藥效是多成分共同作用的結(jié)果，而并非只是某幾個“指標成分”或“主要成分”在起作用[1]。中藥指紋圖譜技術(shù)可對中藥進行成分分析，為中藥質(zhì)量控制的提供依據(jù)。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對樣品不需要進行繁瑣和復雜的前處理，可對已知成分進行定性定量分析，在對未知成分的研究中，質(zhì)譜檢測器可以提供大量的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，或結(jié)合其他方法，即可對未知成分進行定性或定量[2]。

李翔等[3]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立黃芪藥材高效液相-質(zhì)譜檢測器(HPLC-MS)總離子流色譜指紋圖譜，結(jié)果表明黃芪藥材HPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性、精密度和重復性，相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于4.5%，標定13個共有峰，相似度計算結(jié)果均大于0.94。

段天璇等[4]測定甘草甲醇提取物的 HPLC-DAD及HPLC-MS指紋圖譜。結(jié)合文獻對指紋圖譜主要色譜峰進行鑒定，推斷出17個色譜峰中19個可能的成分，給甘草質(zhì)量評價等各類研究提供較全面的化學依據(jù)。

秦澤慧等[5]建立了廣西產(chǎn)兩面針的液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜檢測方法，為最終實現(xiàn)兩面針真?zhèn)纹返蔫b別奠定基礎(chǔ)。以Agilent Zorbax Eclipse C8（ 2.1 mm×100 mm，3.5μm）為分析用色譜柱，甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液（氨水調(diào)pH=4.5）為流動相，采用梯度洗脫，ESI（+）檢測，分析了 15 批廣西產(chǎn)兩面針藥材，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行了相似度計算。結(jié)果建立了廣西產(chǎn)兩面針液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜的共有模式，標定了指紋圖譜中的 22個共有峰，15 批藥材與共有模式的相似度大于0.90。結(jié)論此方法精密度、穩(wěn)定性和重復性良好。

2.2 在研究藥物代謝中的應用

藥物代謝是研究藥物進入人體后，在體液、酶等的作用下進行的生化反應過程[6]。對藥物代謝的研究，包括藥物及其代謝物的分離、鑒定、體內(nèi)體外代謝的比較、代謝途徑的追蹤、痕量分析測定。利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，可以很好地分離純化鑒定代謝物樣品，并且能對以往難于辨識的痕量藥物代謝物進行鑒定及定量分析。

陳勇等[7]以苦參堿和氧化苦參堿為對象，對液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜實驗條件進行優(yōu)化，研究了氧化苦參堿在大鼠體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。健康大鼠腹腔肌注40 mg/kg氧化苦參堿，收集0～24 h的尿樣，尿樣中的代謝物經(jīng)C18小柱進行富集與純化后，在選擇的最佳條件下進樣分析，結(jié)果表示，在大鼠尿樣中有原藥及其6種I相氧化及還原代謝產(chǎn)物，其中苦參堿為主要代謝產(chǎn)物，未檢出II相代謝物。

鄭國鋼等[8]用液質(zhì)聯(lián)用法對人血漿中雷米普利及其活性代謝產(chǎn)物雷米普利拉的濃度進行了測定。以依那普利為內(nèi)標，采用甲醇-0.1%甲酸溶液(75∶25)為流動相,以Waters Atlantis C18色譜柱為分析柱，通過電噴霧電離源(ESI)，以選擇離子反應監(jiān)測(SRM)方式進行檢測。結(jié)果表明雷米普利和雷米普利拉分別在0.103～102.7 ng/mL和0.106～106.4 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。最低檢測限分別為0.05 ng/mL和0.10 ng/mL(S/N=5)。該法專屬性強，樣品處理方便，靈敏度高，適用于雷米普利臨床藥物動力學研究。

晏利芝等[9]分析大鼠灌胃白花蛇舌草有效部位提取物后血漿中對香豆酸、反式6-0-對香豆酰雞屎藤苷甲酯及其代謝產(chǎn)物。取健康雄性SD大鼠按0.4 g/kg的劑量經(jīng)口給予白花蛇舌草有效部位提取物，1.0 h后采集眼眶靜脈血液制備血漿，采用HPLC-Q-TOF-MS進行分析。結(jié)果在大鼠血漿中只檢測到1個代謝產(chǎn)物,并利用對照品鑒定了其結(jié)構(gòu)為對香豆酸。本實驗為研究白花蛇舌草化學成分及藥效作用提供了理論依據(jù)。

2.3 在非法添加化學藥物成分鑒定分析中的應用

近幾年來，為了謀取暴利，一些不法分子在保健品或中成藥中非法添加化學藥物，對人們的身體健康造成了一定的危害。利用LC-MS技術(shù)的高靈敏度及多級質(zhì)譜分析能力，可實現(xiàn)對中成藥及保健食品中非法添加成分的進行快速準確測定，成為各級檢查部門的重要檢測手段。

董宇等[10]建立了液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法檢測中藥降糖制劑中非法摻入苯乙雙胍和格列本脲專屬性方法，并對若干市售藥品進行檢測。選用Diamonsil C18柱，以乙腈-水-甲酸(體積比為 60.0∶40.0∶0.1)為流動相，對中藥降糖制劑的提取液進行液相色譜-離子阱質(zhì)譜分析。結(jié)果在4種受試中藥降糖制劑中，2種被檢測到同時摻有苯乙雙胍和格列本脲，1種被檢測到摻有格列本脲。該方法選擇性強，靈敏度高，可作為分析檢測非法中藥降糖制劑的有效方法。

車寶泉等[11]采用HPLC-MS/MS方法鑒別中藥制劑及保健品中非法添加的10種減肥藥物。利用質(zhì)譜解析軟件研究了上述化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過比較樣品峰與對照品峰的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜質(zhì)荷比，確定樣品中是否摻雜了化學藥物。結(jié)果表明各色譜峰間分離度良好，質(zhì)譜分辨率符合要求，最小檢出量為2～100 ng。

2.4 在農(nóng)藥、獸藥殘留檢測中的應用

食品及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥、獸藥殘留含量甚微，往往需要進行痕量分析，對靈敏度、重現(xiàn)性與選擇性的要求非常高，需要在復雜的基質(zhì)中檢測ppb級甚至更低濃度水平的痕量殘留物質(zhì)。這就需要良好的樣品前處理手段來凈化復雜的食品及農(nóng)產(chǎn)本底，濃縮目標組分，而且需要選擇高性能、高靈敏度的分析系統(tǒng)進行檢測分析[12]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)特別適合于痕量分析，可以鑒別和測定各種類型的農(nóng)藥、獸藥以及生物毒素等殘留物，如動物組織(肌肉、脂肪、肝、腎)中磺胺類、硝基咪唑類、喹諾酮類藥物，水樣中的除草劑、殺蟲劑等。

趙華等[13]對動物性食品中的抗生素類藥物進行提取，再經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，采用電噴霧離子源，以正離子檢測方式進行質(zhì)譜分析。實驗結(jié)果表明,在10～200μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)20種抗生素類藥物濃度與峰面積均呈線性,相關(guān)系數(shù)r>0.99，平均回收率為73.6%～114.6%，相對標準偏差為1.1%～12.0%(n=5)。

殷居易等[14]運用高效液相色譜-大氣壓電離串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(HPLC- APCI(+)MS/MS)內(nèi)標法分析了蜂蜜、蜂王漿及凍干粉中甲硝唑、地美硝唑(二甲硝唑)、替硝唑、洛硝唑(羅硝唑)、特尼噠唑、異丙硝唑,以及羥基化甲硝咪唑、羥基化異丙硝唑、2-羥甲基-1-甲基化-5-硝咪唑9種硝基咪唑類藥物殘留量。蜂蜜和蜂王漿樣品的定量下限(LOQ，S/N>10)為0.5μg/kg，凍干粉樣品的LOQ為1.0μg/kg。在0.5～50.0μg/L范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量濃度呈良好線性，r為0.993 2～0.999 5。

3 結(jié) 語

液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高鑒別特點能力相結(jié)合，組成了較完美的現(xiàn)代分析技術(shù)。近年來，液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在應用方面取得了很大進展，國家標準委、美國FDA及歐盟等權(quán)威機構(gòu)也該技術(shù)引入藥品食品質(zhì)量監(jiān)控中，液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由原先只是少數(shù)專家進行研究的手段發(fā)展成為一種常規(guī)應用技術(shù)。隨著現(xiàn)代化高新技術(shù)的不斷發(fā)展，液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將不斷完善，必將在藥物分析領(lǐng)域中發(fā)揮越來越重要的作用。

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Application of HPLC-MS in Pharmaceutical Analysis

TANG Xue-hong，XIAO Xian-ji
（Xuzhou Industrial Vocational and Technical Institute, Jiangsu Xuzhou 221140，China）

Research progress of HPLC-MS access technique was introduced, and application of HPLC-MS was summarized, such as study of traditional Chinese medicine fingerprint spectrum , drug metabolism analysis, analysis of illegal additive chemical drugs in medication and analysis of residual drugs. With the development of the HPLC-MS technology, HPLC-MS will play an increasingly important role in pharmaceutical analysis.

HPLC-MS; Access technique; Pharmaceutical analysis

TQ 460.72

A

1671-0460（2011）09-0988-03

2011-07-16

唐學紅（1979-），女，江蘇南通人，講師，碩士，研究方向：從事儀器分析方面教學和和科研工作。E-mail：txhxxj@126.com。