帕金森病模型小鼠吸入硫化氫預(yù)防神經(jīng)退行性病變和運(yùn)動(dòng)失調(diào)

（李戰(zhàn)永摘 楊卓審校譯自Antioxid Redox Signal,2011,15:343-352）

帕金森氏病是神經(jīng)退行性疾病之一，神經(jīng)毒素甲基苯基四氫吡啶（MPTP）可致人和動(dòng)物出現(xiàn)帕金森病的癥狀和生化改變。硫化氫（H2S）已被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究使用8～10周的C57BL/6J小鼠造模。采用腹腔注射MPTP溶液（20 mg/kg）的方法，每2小時(shí)1次，共4次，每只小鼠MPTP總量80 mg/kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分2大組：MPTP給藥組和對(duì)照組。MPTP給藥組又分空氣吸入組和H2S吸入組。對(duì)照組小鼠腹腔分次注射與MPTP給藥組小鼠等量的生理鹽水。從給藥當(dāng)天開始，MPTP給藥小鼠置于定制的塑料箱中，每天吸入空氣或混有體積分?jǐn)?shù)為4×10-5H2S的空氣8 h，連續(xù)吸入7 d。每天監(jiān)測(cè)吸入不同氣體小鼠的直腸溫度。給藥后第7天觀察各組小鼠的行為學(xué)改變，包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)。并作組織學(xué)檢查包括酪氨酸羥化酶（TH）含量檢測(cè)，TH免疫印記分析，膠質(zhì)細(xì)胞活性測(cè)定，TUNEL染色以及免疫熒光共染等。給藥后第1、3、7天分別取腦組織，測(cè)定腦內(nèi)谷胱甘肽含量的動(dòng)態(tài)變化。

研究發(fā)現(xiàn)，無論吸入H2S與否，MPTP給藥當(dāng)天均可顯著降低小鼠的體溫，H2S吸入組小鼠在給藥后第1天和第2天能降低體溫，但給藥后第3～6天未發(fā)現(xiàn)體溫降低。與對(duì)照組相比，MPTP給藥后可降低曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠的運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)，減少小鼠在旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中的停留時(shí)間，明顯延長懸尾實(shí)驗(yàn)中小鼠的靜止時(shí)間。H2S吸入7 d后發(fā)現(xiàn)，MPTP給藥導(dǎo)致的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和直立活動(dòng)降低得到改善，小鼠在旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中未見運(yùn)動(dòng)障礙，H2S吸入能抑制MPTP導(dǎo)致的懸尾小鼠靜止時(shí)間增加（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，MPTP給藥7 d后，黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)的TH活性顯著降低，而H2S吸入7 d后可抑制這種TH減少。該結(jié)果也經(jīng)免疫印跡分析方法得到證實(shí)。TUNEL染色結(jié)果證實(shí)，MPTP給藥后1 d可增加黑質(zhì)核團(tuán)內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量。相反，H2S吸入能抑制MPTP給藥所致的凋亡。免疫熒光雙標(biāo)記表明TUNEL染色陽性的胞核僅見于黑質(zhì)，尤其是在TH陽性的細(xì)胞核區(qū)域。盡管大多數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞核沒有被TH陽性細(xì)胞覆蓋，但TUNEL、TH和DAPI三標(biāo)法顯示有少量TH陽性神經(jīng)元包含有TUNEL染色陽性的細(xì)胞核。這些結(jié)果提示至少部分TH陽性神經(jīng)元因凋亡而丟失。H2S吸入可顯著減少M(fèi)PTP導(dǎo)致的TUNEL陽性細(xì)胞。為進(jìn)一步確認(rèn)MPTP給藥后黑質(zhì)內(nèi)凋亡細(xì)胞的類型，研究采用TUNEL染色分別與神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）和離子鈣接頭蛋白抗體（Iba-1）雙標(biāo)記的方法。結(jié)果GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞沒有覆蓋任何TUNEL陽性細(xì)胞，而Iba-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞包圍TUNEL陽性細(xì)胞。實(shí)際上，TUNEL、Iba-1和DAPI三標(biāo)記顯示大多數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞差別明顯，提示凋亡的神經(jīng)元被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬。上述結(jié)果表明，MPTP導(dǎo)致黑質(zhì)內(nèi)TH陽性神經(jīng)元凋亡，而這些凋亡的神經(jīng)元又被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬。免疫熒光染色表明對(duì)照組小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)和紋狀體很少有活性的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，MPTP給藥后第1天即可增加黑質(zhì)內(nèi)活性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。紋狀體內(nèi)，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在MPTP給藥后第1天增多，而星形膠質(zhì)細(xì)胞在MPTP給藥后第7天增多。H2S吸入能對(duì)抗MPTP給藥所致的黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。為探究H2S吸入具有神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，本研究測(cè)定了核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）調(diào)節(jié)的基因編碼抗氧化蛋白和去毒酶（GST Mu1，NQO1，HO-1，GST A4，GCLC）的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPTP不影響GST Mu1、NQO1和HO-1表達(dá)，但降低GST A4和GCLC的表達(dá)，H2S吸入增加MPTP給藥后第1天小鼠的上述5種蛋白基因的表達(dá)。這些結(jié)果提示吸入H2S可通過上調(diào)Ⅱ相去毒酶和抗氧化蛋白來發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。此外，MPTP在給藥后第1、3、7天，無論是否吸入H2S，均未顯著影響黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）水平以及還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比率（GSH/GSSG），提示谷胱甘肽水平降低與MPTP和（或）H2S無關(guān)。

本研究顯示，連續(xù)7 d每天吸入體積分?jǐn)?shù)為4×10-5的H2S，可對(duì)抗MPTP導(dǎo)致的帕金森模型小鼠的神經(jīng)退行性變和運(yùn)動(dòng)失調(diào)。H2S吸入的神經(jīng)保護(hù)作用與其顯著減少M(fèi)PTP所致的黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)含TH神經(jīng)元丟失有關(guān)。H2S吸入可抑制MPTP給藥后第1天黑質(zhì)紋狀體內(nèi)神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)增生。H2S吸入還能上調(diào)黑質(zhì)紋狀體區(qū)Ⅱ相去毒酶和抗氧化蛋白，該作用至少部分與上調(diào)Nrf2依賴性抗氧化保護(hù)機(jī)制有關(guān)?？傊?，本研究結(jié)果證明，H2S吸入可對(duì)抗MPTP給藥后對(duì)小鼠造成的毒性作用。