廢舊免疫組化液體石蠟筆的再利用技術(shù)

鄭燕璇 王曉鴻

免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用免疫學(xué)抗體與抗原結(jié)合的原理以及細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對組織、細(xì)胞特定抗原或抗體進(jìn)行定位定量研究的技術(shù)。它廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、組織解剖學(xué)、病理學(xué)等[1]。做免疫組化不外乎兩種方法:漂片法或貼片法[2]。然而，前者容易爛片，不適合做腦片等大而易碎的組織;后者方法較好，但為了保持良好的染色效果和節(jié)省抗體，常常需要免疫組化筆。免疫組化筆無論是國產(chǎn)還是進(jìn)口，都有在使用過程中液體石蠟流出不暢或使用中用力過大導(dǎo)致液體石蠟流出過多污染片子，免疫組化液體石蠟筆使用到后期隔水性差，同時圈片數(shù)量有限，且價格昂貴。我們通過多次實驗，摸索出一種廢舊免疫組化液體石蠟筆的再利用技術(shù)，其防水性好、價格低廉、可保證免疫組化效果。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用品和器械 樹膠2 ml(中國上海懿洋儀器有限公司)、廢舊免疫組化液體石蠟筆一支、30張貼有腦片的載玻片(每張載玻片2張腦片)、0.05 m的PBS、各種抗體、MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色劑(AEC顯色劑)(購于邁新試劑)、濕盒、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、冰箱、普通顯微鏡等。

1.1.2 實驗分組 實驗分3組:甲組用美國進(jìn)口免疫組化筆畫圈;乙組用國產(chǎn)一般免疫組化筆(福州邁新公司生產(chǎn))畫圈;丙組用廢舊免疫組化液體石蠟筆畫圈。每組15張載玻片(30張腦片)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化筆的制作方法 將廢舊免疫組化液體石蠟筆放入二甲苯中，將筆芯中殘留的液體石蠟徹底溶解去除干凈之后取出，這樣就制成了一只再利用免疫組化筆。

1.2.2 免疫組化筆的使用方法 用小瓶倒入2 ml樹膠，加入適量二甲苯稀釋樹膠，將再利用免疫組化筆蘸少量稀釋后樹膠圍繞切片組織周圍0.2 cm處畫圈，樹膠不能覆蓋切片上的組織。

1.2.3 免疫組化MaxVisionTM法(試劑盒及抗體均購于福州邁新試劑公司)[3]。①石蠟切片脫蠟和水化后，用 PBS(pH7.4)沖洗3次，3 min次。②根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。③如果有必要(內(nèi)源性過氧化物酶含量過高的組織)，每張切片加一滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，3 min/次。④除去PBS液，每張切片加一滴或50 μl的第一抗體(用戶自選)，室溫下孵育60 min或4℃過夜，建議參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，3 min/次。⑤除去PBS液，每張切片加一滴或50 μl即用型MaxVisionTM試劑，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3次，3 min/次。⑥除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3～5 min(DAB)或10 min(AEC)。⑦自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍(lán)。如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封固;如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。

1.2.4 結(jié)果觀察及統(tǒng)計學(xué)處理觀察整個實驗過程中再利用免疫組化筆的隔水性效果;鏡下觀察組織切片中抗原與抗體結(jié)合后抗原在免疫組化中陽性反應(yīng)物的表達(dá)情況，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理、分析。

2 結(jié)果

2.1 3種免疫組化筆隔水率的比較 美國產(chǎn)免疫組化筆的隔水率為90%;國產(chǎn)免疫組化筆的隔水率為80%;而再利用的免疫組化筆的隔水率可達(dá)90%。

2.2 3種免疫組化筆對免疫組化試驗陽性結(jié)果的影響 鏡下大體觀察發(fā)現(xiàn):用再利用的免疫組化筆畫圈的切片陽性結(jié)果良好，而用美國產(chǎn)免疫組化筆畫圈的切片雖有陽性結(jié)果，但片子周圍有時有污染現(xiàn)象。

3 討論

我們在多次免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn):市售的各種免疫組化液體石蠟筆有時會出現(xiàn)使用不暢，甚至根本畫不出來，有時畫片時稍用力過大，液體石蠟就會從筆芯中溢出過多污染切片，是影響免疫組化結(jié)果的因素之一，而且此筆價格昂貴，一桿國產(chǎn)筆價格大約在400元左右，畫圈不超過200個筆芯中的液體石蠟即用完。為此，我們通過多方探索找到了理想的替代品:中性樹膠。樹膠是一種天然樹脂，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)，作為生物切片的封藏劑，它可溶于二甲苯、苯、甲苯、二氧氯環(huán)等，不溶于水[3]。中性樹膠中加入適量二甲苯稀釋，可使樹膠易浸入筆芯中，在切片上畫圈時使之順暢，同時二甲苯揮發(fā)后樹膠畫的圈淡且薄，但卻不影響隔水效果。免疫組化組織切片染色后需用中性樹膠封片，封片用的樹膠與畫圈用的樹膠相互溶合，不會形成污染。故此，我們應(yīng)用其特性再利用了廢舊的免疫組化筆，在實驗中不但節(jié)約了大量的資金，而且使用方便耐用，3 ml樹膠可畫300個圈左右，代價大約只有2元錢。最重要的是它不影響免疫組化結(jié)果，由于隔水性能好，保證了抗原抗體的充分結(jié)合，增強(qiáng)了免疫組化的效果，節(jié)約各種抗體及試劑盒各試劑，故可推薦使用。

[1]李成文.現(xiàn)代免疫化學(xué)技.上海:上?？萍汲霭嫔?，1992:97-100.

[2]朱長庚.神經(jīng)解剖學(xué).第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:87.

[3]杜卓民.實用組織學(xué)技術(shù).北京:人民衛(wèi)生出版社，1982:63.