劉洪鳳 任巖海 韓智學(xué) 崔榮軍 王桂云 申梅淑 宋高臣
(牡丹江醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,黑龍江 牡丹江 157011)
目前對胰島素抵抗(IR)發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)已集中在分子及基因水平。胰島素受體后缺陷在IR的環(huán)節(jié)中意義尤為突出。其中外周組織對葡萄糖攝取、利用的減少是受體后IR的主要原因。即葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4),是介導(dǎo)葡萄糖攝取的因子,其介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是外周組織葡萄糖利用的限速步驟,這一過程發(fā)生障礙則引起IR、高血糖癥和肥胖。GLUT4在葡萄糖動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用,是一種十分重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,與 IR和2型糖尿病(T2DM)密切相關(guān)〔1〕。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要活性成分,有明顯降血糖作用〔2~4〕,但是從分子生物學(xué)角度研究其降糖機(jī)制還未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察APS對T2DM模型大鼠的GLUT4 mRNA表達(dá)的影響,探討其降低T2DM大鼠IR的分子生物學(xué)機(jī)制,為其治療T2DM提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級Wistar大鼠84只,體重(250±50)g,雌雄各半,購自佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。APS(惠州市東方植物保健科技有限公司提供);鏈脲佐菌素(Sigma公司產(chǎn)品);RT-PCR試劑(TOYOBO公司產(chǎn)品);PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
1.2 大鼠模型的制備及分組 Wistar大鼠84只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)選取70只大鼠,給以高脂高糖飲食喂養(yǎng);另取正常大鼠14只,給以基礎(chǔ)飼料飲食。8 w后,共篩選出IR模型大鼠62只,尾靜脈注射STZ注射液25 mg/kg;正常組大鼠,注射相同體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。2 d后,以11.1 mmol/L≤FBG<33.3 mmol/L且伴有糖耐量減退和IR者為早期T2DM胰島素抵抗大鼠模型成功。將造模成功的56只大鼠隨機(jī)分為4 組:模型對照組及 APS 800、400、200 mg·kg-1·d-1治療組,腹腔灌胃12 w后,空腹取材后處死大鼠。
1.3 脂肪組織GLUT4 mRNA水平檢測 Trizol法提取大鼠腎周白色脂肪組織總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳RNA顯示18 S、28 S兩條帶,紫外分光光度計(jì)測A值,計(jì)算RNA樣品純度,A260:A280>1.8表明純度高。mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 4 min 1個循環(huán),94℃變性 45 s,60℃退火 45 s,72℃延伸 45 s,35 個循環(huán)后 72℃延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參照。GLUT4(379 bp)上游引物序列:5'-AGCCAGCCTACGCCACCATA-3',下游引物序列:5'-GGACCCATAGCATCCGCAAC-3';β-actin(225 bp)上游引物序列:5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3',下游引物序列:5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果用UVPDGS-8000型凝膠成像系統(tǒng)成像,并用密度掃描儀分析PCR產(chǎn)物條帶。GLUT4 mRNA表達(dá)水平以相對光密度表達(dá)量,即GLUT4/β-actin比率計(jì)算。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包處理,定量資料數(shù)據(jù)以±s表示,對組間均數(shù)比較進(jìn)行單因素方差分析。
擴(kuò)增后得到GLUT4(379 bp)和β-actin(225 bp)兩個片段。圖像分析結(jié)果顯示,與正常對照組相比(0.65±0.07),模型組大鼠GLUT4 mRNA表達(dá)明顯降低(0.38±0.08,P<0.01);與模型對照組比較,APS高、中劑量治療組GLUT4 mRNA表達(dá)明顯增高(0.59±0.06,0.63±0.05,P <0.01),低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.41±0.06,P>0.05)。
在T2DM中IR的發(fā)病機(jī)制,最主要的因素是骨骼肌和脂肪組織存在IR,IR是T2DM的病理生理過程,IR表現(xiàn)為肌肉、脂肪對葡萄糖攝取減少和抑制肝葡萄糖輸出的作用減弱。許多研究表明,胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙可以直接引起IR,而胰島素刺激是通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子使葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),維持機(jī)體糖和脂代謝平衡的〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①與正常對照組比較,模型組大鼠脂肪組織GLUT4 mRNA表達(dá)顯著降低,提示GLUT4基因可能與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān);②與模型組比較,APS高、中劑量治療組脂肪組織GLUT4 mRNA表達(dá)顯著升高,提示APS降低血糖、降低IR作用,可能與上調(diào)GLUT4 mRNA表達(dá)有關(guān)。因此,GLUT4基因有可能成為治療IR新的藥物作用靶點(diǎn),但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
1 XU PY.Dissecting multiple steps of GLUT4 trafficking and identifying the sites of insulin action〔J〕.Cell Metabolism,2007;20(5):47-57.
2 陳 蔚,俞茂華,葉紅英,等.黃芪多糖保護(hù)糖尿病心肌的初步研究〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007;34(4):541-4.
3 蔡 莉,朱 江.黃芪多糖研究現(xiàn)狀與進(jìn)展〔J〕.中國腫瘤臨床,2007;34(15):896-900.
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