乳酸菌重組表達抗菌肽研究進展

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所 許文杉 馮興軍＊

抗生素的不合理應(yīng)用及濫用，使得耐藥性問題日益突出。近年來，耐藥菌株以及細菌耐藥造成的后果也日趨嚴(yán)重。因此，尋求新型抗菌藥物的任務(wù)就變得尤為迫切?？咕囊蚱鋸V譜高效抗菌活性及獨特的抗菌機制而在新型抗菌藥物研究中顯露出明顯優(yōu)勢。

乳酸菌能夠產(chǎn)生一些抑菌或殺菌物質(zhì)，如乳酸鏈菌肽（nisin）就是乳鏈球菌代謝產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)（小分子抗菌肽），已被世界上50多個國家和地區(qū)應(yīng)用為食品的天然防腐劑 （Beisswenger和Bals，2005；Kim 和 Broden，2005）。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，乳酸菌作為一種新型的重組表達系統(tǒng)，具有巨大的應(yīng)用與發(fā)展前景。乳酸菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，表達的外源蛋白無需經(jīng)過純化可以直接連同菌體一起服用，利用乳酸菌作為表達載體制成口服疫苗已有不少報道（Gaczynska等，2003）?？咕姆蛛x純化困難且成本較高，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到很大限制，尋找合理有效且能夠方便應(yīng)用的方法成為解決抗菌肽應(yīng)用受限的關(guān)鍵問題。近年來，乳酸菌重組表達抗菌肽展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。本文就抗菌肽在乳酸菌中重組表達研究進展進行綜述。

1 乳酸菌表達系統(tǒng)

1.1 LAB表達系統(tǒng)的表達載體 乳酸菌作為表達抗菌肽的宿主菌，除了必須得到適合基因操作的菌株外，還必須建立合適的載體。用于LAB表達系統(tǒng)的表達載體一般包括以下幾個基本組成部分：啟動子、用于篩選的標(biāo)記基因、復(fù)制子、多個用于外源基因插入的內(nèi)切酶位點。從目前的報道來看，表達載體通常使用誘導(dǎo)型的啟動子（Andrea等，2000）， 主要有 lacA∕lacR，nisA∕nisZ，trpE，pal70等，其中前三種來源于L.lactis，pal70屬于誘導(dǎo)型啟動子低溫或低pH值啟動表達。使用nisA∕nisZ啟動子的乳酸菌表達系統(tǒng)表達過多種外源基因（Wegmann等，2007），是最常用的表達系統(tǒng)之一，誘導(dǎo)物Nisin是安全、無毒害的，誘導(dǎo)作用與誘導(dǎo)物乳鏈菌肽的濃度在一定范圍內(nèi)成正比（王海英和祁克宗，2007）。啟動子來自于抗菌肽的基因?qū)偈称芳墶ＴS多帶nisA/nisZ啟動子的表達載體上不再用抗生素抗性篩選標(biāo)記，而是用一些食品級的篩選標(biāo)記，如lacF。研究表明，利用乳酸菌基因組探索乳酸菌的抗菌潛力及其作為生物防腐劑在食品保藏中有很大的應(yīng)用前景 （易華西和張?zhí)m威，2009）。目前，在乳酸乳球菌中發(fā)現(xiàn)了受pH值調(diào)節(jié)的啟動子（p170），對其進行缺失突變發(fā)現(xiàn)p170的pH誘導(dǎo)作用提高了 150倍（Madsen等，1999）。

1.2 篩選標(biāo)記 對于篩選標(biāo)記基因，過去常用的表達載體一般以抗生素抗性基因作篩選標(biāo)記，使用最多的是Cmr、Amp兩種基因。由于這類標(biāo)記基因?qū)股鼐哂锌剐?，并且在轉(zhuǎn)化過程中需要使用一定的抗生素進行篩選，因此帶來了一些安全性問題。新開發(fā)的載體，主要采用對人體無害的非抗生素抗性基因作選擇標(biāo)記。現(xiàn)在用于乳酸桿菌表達系統(tǒng)的食品級選擇性標(biāo)記主要有三類：糖類利用標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、編碼細菌素抗性。如此，構(gòu)建出的乳酸桿菌表達系統(tǒng)、載體、受體及誘導(dǎo)物均達到食品級，可直接制成口服制劑。當(dāng)啟動子的誘導(dǎo)物也為食品級時，表達載體可與相應(yīng)的LAB宿主菌一起構(gòu)成一個食品級表達系統(tǒng)。

1.3 信號肽 由于乳酸桿菌可分泌大量的S－層蛋白，因此可以選擇利用S－層蛋白的高效表達信號，攜帶外源基因進行分泌表達。作為同一種屬的乳酸桿菌的S－層蛋白信號肽基因的同源性極高，可以將一種具有更強分泌作用的乳酸桿菌的信號肽應(yīng)用到另一種乳酸桿菌表達系統(tǒng)中，以期獲得高效分泌。但要考慮信號肽切割位點前后的幾個氨基酸，因為這關(guān)系到外源蛋白分泌后信號肽能否正確切除（陳德富和陳喜文，2006），因此通過克隆乳酸桿菌S－層信號肽基因，就可為進一步構(gòu)建乳酸桿菌的分泌表達系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)，也為構(gòu)建分泌表達外源抗原的基因工程乳酸桿菌提供基本素材。

將目的基因序列引入信號肽基因序列下游，使其與自然存在的分泌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相符，就可以構(gòu)建分泌型表達載體。但同時要注意以下幾點：第一，信號肽的選擇及信號肽序列的改造。在構(gòu)建載體時加入新的信號肽有可能提高外源蛋白分泌，如果對信號肽本身進行適當(dāng)改造，將會顯著提高外源蛋白的表達量。第二，信號肽切割不完全現(xiàn)象。這會使所分泌的蛋白質(zhì)帶有多余的氨基酸殘基，因此必須消除信號肽切除不完全現(xiàn)象，才能獲得與天然蛋白質(zhì)一致的氨基酸序列。第三，信號肽酶的酶切效率。研究表明，用HindⅢ酶切去掉pZLBe7中的β-內(nèi)酰胺酶基因片段，構(gòu)建成乳酸菌分泌型表達載體，用此載體在乳酸菌中表達和分泌一些有價值的外源基因，以研究乳酸菌中基因產(chǎn)物表達和分泌的機制 （陳秀株和劉宗旨，2001）。

2 抗菌肽在乳酸菌中的重組表達

作為乳酸菌的模式菌，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的完整基因組測序已經(jīng)完成，為乳酸菌基因工程的發(fā)展和表達載體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。進一步的研究闡明了乳酸菌染色體及與質(zhì)粒有關(guān)的基因結(jié)構(gòu)和功能，并完整地繪制出L.lactis和植物乳桿菌 （Lb.plantarum）的基因組圖譜（Mathiesen等，2004）。由于LAB的染色體基因組小，而且許多功能性物質(zhì)是由其染色體外質(zhì)粒上的基因所編碼的，所以經(jīng)改造后去除了質(zhì)粒的菌株幾乎不分泌任何本源蛋白，非常適合用于外源基因的表達（Christiaens等，1992）。目前國內(nèi)外研究者已經(jīng)成功克隆了一些抗菌肽的基因和cDNA，并已在大腸桿菌、家蠶細胞、粉紋夜蛾末齡幼蟲和天蠶滯育蛹、Sf21細胞以及酵母細胞等原核或真核體系中得以克隆表達，擴大了抗菌肽基因的資源。研究證實，將L.lactis用于大規(guī)?；虮磉_，并代替E.coli成為外源蛋白質(zhì)表達的宿主菌具有諸多優(yōu)勢（Mierau等，2005）。主要體現(xiàn)在兩方面：（1）乳酸乳球菌的胞外蛋白酶很少，當(dāng)以胞外蛋白酶含量少的菌株作為宿主菌時，通過信號肽介導(dǎo)的胞外的分泌表達可以一定程度上消除胞內(nèi)蛋白酶對抗菌肽的降解，而增加目標(biāo)肽的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。比較而言，大腸桿菌和酵母作為宿主都含有一定的胞外蛋白酶，而抗菌肽所攜帶的堿性氨基酸使其對這些蛋白酶很敏感，表達的抗菌肽在表達細胞中也容易被降解。試驗證明，通過雙質(zhì)粒的引入，其中的一個質(zhì)粒含有Lactococcin A的分泌表達相關(guān)基因 （lcncD），成功地在產(chǎn)nisin的乳酸乳球菌中分泌表達了抗菌肽Laetoeoeein A，實現(xiàn)了nisin和LaetoeoeeinA的高水平共表達，避免了乳酸乳球菌胞內(nèi)蛋白酶的降解，同時有利于蛋白的純化過程 （Fernandez等，2004）。而且，乳酸菌是安全級微生物，可以口服，免去一般基因工程菌所需的繁瑣提取工藝，為基因工程生產(chǎn)廉價、安全的生物制品開辟了新途徑。（2）乳酸菌具有強烈的、高度可調(diào)控的啟動子系統(tǒng)，可表達毒素基因，在細胞內(nèi)和細胞表面均可表達，并分泌到胞外培養(yǎng)基中。通過對api-daecin的結(jié)構(gòu)進行分析，構(gòu)建了乳酸乳球菌分泌表達載體，實現(xiàn)了apidaecin在乳酸乳球菌中的分泌表達（周緒霞，2008）。乳酸菌與其他細菌比較，其蛋白質(zhì)水解能力較弱，這對外源蛋白的表達極為有利。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌對維持微生態(tài)平衡具有重要作用，具有控制腸道感染、誘導(dǎo)體內(nèi)特異性及非特異性免疫應(yīng)答以及抗突變和抗輻射作用，還可以減緩乳糖不耐癥等功效（劉小青等，2009）。

3 存在的問題

乳酸菌作為表達功能性蛋白和外源抗原的條件相對成熟，然而，利用乳酸菌表達抗菌肽仍面臨一些問題：（1）遺傳背景相對薄弱。大腸桿菌表達是現(xiàn)今掌握最為成熟的表達系統(tǒng)，目前運用大腸桿菌進行的抗菌肽基因工程研究是主要方式。關(guān)于乳酸菌遺傳背景的認識相對前者還較薄弱。（2）表達效率不穩(wěn)定。研究顯示，經(jīng)nisin誘導(dǎo)表達的陽性單克隆用超聲波破碎，取細胞裂解后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測，與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker比較顯示4.5 kD未見到目的條帶。這主要是因為乳酸菌表達系統(tǒng)在表達外源基因蛋白時表達量比較少造成的（楊濤，2009）。（3）信號肽分泌效率不穩(wěn)定。信號肽對不同的異源蛋白分泌效率有很大的差異，信號肽的分泌效率受胞內(nèi)外源蛋白mRNA水平、微生物培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件的影響（Bron等，2004）。盡管乳酸菌基因表達系統(tǒng)可以使蛋白質(zhì)高效表達，但是仍有許多蛋白質(zhì)表達量低、純度不高、活性差，嚴(yán)重影響外源蛋白的生產(chǎn)，因此真正推向市場的高效產(chǎn)品并不多。利用一些特定的信號序列，使某些蛋白質(zhì)分泌或正確定位，可為一些以特定細胞器為靶點的新藥研制提供新途徑，在一定水平上將使細胞有序地成為基因治療的入手點。

4 展望

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，乳酸菌表達系統(tǒng)也得到了進一步開發(fā)和應(yīng)用。目前，已通過食品級乳酸菌基因表達系統(tǒng)表達出丙氨酸消旋酶、真核生物蛋白質(zhì)、活菌疫苗等生物制品。乳酸菌食品級基因表達系統(tǒng)的研究和應(yīng)用具有相當(dāng)大的潛力，隨著科學(xué)研究及認識的不斷深入，設(shè)計合成新型抗菌肽的基因，建立高效的乳酸菌表達體系和廉價、快速的純化系統(tǒng)，對于抗菌肽應(yīng)用于畜牧業(yè)、實現(xiàn)畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

[1]陳德富，陳喜文.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗原理與技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2006.28.

[2]劉小青，萬翠香，徐鋒，等.乳酸菌的安全性研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21（10）：952 ～ 955.

[3]王海英，祁克宗.乳酸菌食品級基因表達系統(tǒng)的研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，1（3）：8 ～ 9.

[4]楊濤.雞Gal-8 cDNA的克隆及在大腸桿菌和乳酸菌中的表達 [D].安徽：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[5]易華西，張?zhí)m威.乳酸菌細菌素抗菌潛力挖掘研究進展[J].中國食品添加劑，2009，5（5）：73 ～ 756.

[6]周緒霞.Apidaecin功能基團及其作用靶位點的分析及其在乳酸乳球菌中的分泌表達[D].浙江：浙江大學(xué)，2008.

[7]Andrea M，Mark S T，Phil G.Analysis of promoter sequences from lactobacillus and lactococcus and their activity in several Lactobacillus species[J].Archives of Microbiology，2000，173：383 ～ 389.

[8]Beisswenger C，Bals R.Functions of antimicrobial peptides in host defense and immunity[J].Curr Protein Pept Sci，2005，6（3）：255 ～ 264.

[9]Bron P A，Benchimol M G，Lambert J，et al.Use of the alr gene as a foodgrade selection marker inlactic acid bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2002，68（11）：563 ～ 567.

[10]Christiaens H，Leer R J，Pouwels P H.Cloning and expression of a conjugated bile acid hydrolase gene from Lacto-bacillus plantarum by using a direct plate assay[J].Appl Environ Microbiol，1992，58（3）：792.

[11]Fernandez，Horn，Gasson，et al.High–level coproduction of the bacterioeins nisin A and lactococcin A by Lactoccus lactis[J].J Dairy Res，2004，7（1）：216～221.

[12]Gaczynska M，Osmulski P A，Gao Y，et al.Proline-and arginine-rich peptides constitute a novel class of allosteric inhibitors of proteasome activity[J].Biochemistry，2003，42（29）：863 ～ 867.

[13]Kim A，Broden.Antimicrobial peptides：poreformers or metabolic inhibitors in bacteria[J].Nature Reviews Microbiology，2005，239（3）：238 ～ 250.

[14]Madsen S M，Arau J，Vrang A，et al.Molecular earacterization of the pH inducible and growth phase dependent promoter P170 of Lactococcus lactis[J].Mol Micribiol，l999，32：75 ～ 87.

[15]Mathiesen G S，Urvig E，Blatny J，et al.High-level gene expression in Lactobacillus plantarum using a pheromone-regulated bacteriocin promoter[J].Lett Appl Microbiol，2004，39（2）：137.

[16]Mierau I，Olieman K，Mond J，et al.Optimization of the Lactococcuslactisnisin controlled gene expression system NICE for industrial applications[J].Microbial Cell Factories，2005，4：16.

[17]Wegmann U，O’Connell-MotherwayM，Zomer A，et al.The complete genome sequence of the lactic acid bacterial paradigm Lactococcus lactissubspcremoris MG1363[J].J Buct，2007，189（8）：325 ～ 327.