黑麥草高溫脅迫抗性與抗旱性遺傳育種研究進展

謝宏偉,徐慶國,李 陽

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長沙 410128)

隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展,牧草育種與栽培研究為其奠定了重要基礎(chǔ)。黑麥草屬(Lolium L.)植物作為牧草栽培利用的主要是一年生黑麥草和多年生黑麥草。近年來,由于各種自然災(zāi)害的影響使得自然環(huán)境受到破壞,農(nóng)作物產(chǎn)量降低,因此抗逆育種成為目前作物研究的首要方面。為了總結(jié)黑麥草抗熱育種和抗旱育種的研究成果,以便更好地種植黑麥草,筆者對有關(guān)黑麥草高溫脅迫和水分脅迫的研究與應(yīng)用進行了綜述。

1 高溫脅迫對黑麥草的影響

1.1 對農(nóng)藝性狀的影響

高溫脅迫下黑麥草的生長速度受到影響。李善林等的研究結(jié)果顯示:在設(shè)定的狗尾草密度范圍內(nèi),當(dāng)黑麥草生長高度與狗尾草生長高度相近時遭遇干旱和高溫,7 d后黑麥草植株增長的高度存在差異[1]。同時高溫可引起黑麥草生長狀況下降,最初的傷害癥狀出現(xiàn)在倒數(shù)第2,3片葉葉鞘的交接處,但葉片卻部分萎蔫,從基部到頂尖逐步發(fā)黃,進一步的傷害就會發(fā)生在倒4葉和較老的葉片上[2,3]。

高溫脅迫影響黑麥草的生長發(fā)育,對生育期的長短有影響。不同的播種時期在一定程度上影響黑麥草的高溫脅迫程度。丁成龍等進行的試驗表明不同播種期對多花黑麥草全生育期天數(shù)有較大的影響,隨著播種期的延遲成熟期推遲[4]。

高溫降低黑麥草發(fā)芽率和幸存植株百分率,使干物質(zhì)產(chǎn)量下降。當(dāng)受熱組織達到35～ 43℃時,黑麥草會呈現(xiàn)直接致死作用,受熱脅迫的組織顏色轉(zhuǎn)褐色繼而腐爛[5]。

1.2 對生理生化性狀的影響

高溫脅迫對植物造成的熱害主要表現(xiàn)為:蛋白質(zhì)變性,光合作用和呼吸作用的速率下降,隨后是生物膜的結(jié)構(gòu)破損,透性喪失,質(zhì)體的類囊體瓦解,質(zhì)液外滲,致使植物體內(nèi)生理生化代謝紊亂[6]。葉綠體受損導(dǎo)致光合作用受到抑制,植株因“饑餓”而死亡[7]。高溫能使O2的溶解度減小,因而抑制植物的有氧呼吸,無氧呼吸增強并積累有毒物質(zhì),如乙醇、乙醛、氨等毒害細胞[8]。

1.2.1 葉綠體

萬里強等試驗研究顯示,在35℃連續(xù)高溫脅迫下,黑麥草的葉綠體受到嚴重損壞[9]。另外,由于葉綠體類囊體受熱降解,降解產(chǎn)物脂質(zhì)發(fā)生集結(jié),故在受傷害較重的葉綠體內(nèi)部,出現(xiàn)脂質(zhì)球體數(shù)目增多和體積增大現(xiàn)象[10]。王光耀等和甄偉等研究表明,葉綠體基質(zhì)片層對高溫脅迫最敏感[11,12]。從耐熱性角度講,耐熱性好的品種在熱脅迫條件下,可維持相對較高的葉綠素含量,保持一定的光合潛能。相反,耐熱性差的品種在外界熱脅迫下,葉綠體降解加快,葉綠素含量偏低,光合能力下降[13]。

1.2.2 丙二醛

丙二醛(MDA)能在逆境下保持細胞膜的完整和穩(wěn)定,是植物抗逆性的重要方面[14]。逆境導(dǎo)致膜脂過氧化是膜傷害的原因之一,MDA是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一,會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細胞毒性。積累量越大,說明細胞受損程度越大,因此應(yīng)減少 MDA含量,增強黑麥草的抗逆性。

1.2.3 葉片膜質(zhì)透性

當(dāng)植物受到逆境影響時,葉片細胞膜遭到破壞,膜透性增大,從而使細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲,導(dǎo)致植物細胞浸提液的電導(dǎo)率增大[15]。一般認為耐熱性強的黑麥草種或品種在高溫處理后細胞外滲液的電導(dǎo)率較低[16]。

1.2.4 過氧化物酶

過氧化物酶(POD)廣泛存在于植物體中,是活性較高的一種酶,它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化,一般老化組織中活性較高,幼嫩組織中活性較弱。它們都是膜脂過氧化的主要保護酶系。熊作明等研究發(fā)現(xiàn),高溫條件下黑麥草 POD活性增強,表明高溫下黑麥草抵抗逆境的自我保護也在增強[17]。

1.2.5 分子生物學(xué)指標

有關(guān)黑麥草分子生物學(xué)指標的報道較少,主要集中在熱擊蛋白(heat shock protein,HSP)的研究上。HSP是指生物體在受到高于植物正常生長溫度 8～12℃脅迫時合成新的或合成增強的蛋白質(zhì)[18]。在分子水平上,熱擊反應(yīng)的特點是正常蛋白合成終止,瞬時合成 HSP,從而維持細胞活力水平。 HSP量的積累可使細胞具有高水平的耐熱性[19,20]。

2 黑麥草高溫脅迫抗性的種和品種間差異

黑麥草品種耐熱性是一個綜合指標,是牧草在夏季高溫季節(jié)經(jīng)受高溫、高濕、干旱和病蟲害等多種因素脅迫下的一種綜合表現(xiàn)[21]。段碧華等通過生化培養(yǎng)箱對紫羊茅、草地早熟禾和多年生黑麥草進行 4種溫度熱脅迫處理,其耐熱性能的強弱順序為:紫羊茅>草地早熟禾>多年生黑麥草[22]。石永紅等運用電導(dǎo)率法對6個黑麥草牧用品種進行耐熱性測定,結(jié)果顯示它們耐熱性的強弱次序是雅晴>歐必克>努依>多福>鳳凰>卓越[16]。黑麥草耐熱性強的品種較耐熱性弱的品種無論是在高溫還是在常溫下均具有更高的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性[23～25],且以不耐熱的品種的變化幅度大于耐熱品種[26,27]。

3 黑麥草高溫脅迫的鑒定指標和鑒定方法

3.1 黑麥草高溫脅迫的鑒定指標

(1)農(nóng)藝性狀鑒定指標。越夏率和缺水狀況下與高溫條件下的凋謝率,另外高溫脅迫中葉片的葉型和葉色等是衡量品種耐熱性的重要形態(tài)指標[28]。

(2)生態(tài)指標:半致死溫度。

(3)生理生化指標。包括可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、核酸含量、磷脂含量、不飽和脂肪酸含量、游離氨基酸含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、過氧化物酶活性、抗壞血酸含量、電導(dǎo)率、電阻值、pH值等。

3.2 黑麥草高溫脅迫的鑒定方法

3.2.1 活力測定法

大多數(shù)牧草的抗熱性鑒定方法是通過田間生長試驗測定植物的越夏性而對其溫度脅迫抗性進行鑒定。但越夏性不等于抗熱性,因此,高溫處理結(jié)合活力測定才是鑒定黑麥草抗熱性的可靠方法。王欽等利用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法測定了高溫脅迫后植株傷害率和植株存活率[29]。

3.2.2 電導(dǎo)率測定法

已被公認的耐熱性鑒定指標有細胞外滲液電導(dǎo)率。細胞膜透性的穩(wěn)定性(CMT)是測定離體葉片的滲透情況在一定溫度范圍內(nèi)的特性,是一種靈敏、快捷的估測植物抗熱性的方法。CM T可以預(yù)測全株耐熱性。用 T TC法測定熱脅迫后的組織活力,具有方法簡便的優(yōu)點。但易高估耐熱性,這一問題可通過在測試前清洗細胞加以改進[30～33]。石永紅等運用電導(dǎo)率法通過Logistic拐點確定半致死溫度初步確定各個品種的耐熱性[16]。

3.2.3 生理生化指標測定法

耐熱性測定的常用生理生化指標有:游離脯氨酸含量、丙二醛含量、過氧化氫酶活性等,它們對應(yīng)的測定方法為:酸性茚三酮法測定,雙組分分光光度計法和紫外分光光度法測定。在高溫脅迫下,植物葉片相對傷害率越低,細胞膜的熱穩(wěn)定性就越高,耐熱性就越強[34]。

4 黑麥草高溫脅迫抗性的機理

由高溫引起植物的傷害稱為熱害,可以分為直接傷害和間接傷害。

4.1 高溫對黑麥草的直接傷害

直接傷害是高溫直接影響細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu),在短期(幾秒到幾十秒)出現(xiàn)癥狀,并可從受熱部位向非受熱部位傳遞蔓延,最終致使細胞受損。其傷害實質(zhì)較復(fù)雜,可能原因是由于高溫引起蛋白質(zhì)構(gòu)型變化而變性以及膜脂的液化,使膜失去半透性和主動吸收的特性[8]。高溫常引起植物過渡蒸騰失水,此時同旱害相似,因細胞失水而造成一系列代謝失調(diào),導(dǎo)致生長不良。

4.2 高溫對黑麥草的間接傷害

間接傷害是指高溫導(dǎo)致代謝異常,漸漸使植物受害,其過程是緩慢的。熱害的間接傷害具體表現(xiàn)為以下幾方面:(1)由于在較高溫度下牧草植物的呼吸作用大于光合作用,貯存的營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快,造成饑餓;(2)高溫下牧草植物組織內(nèi)氧分壓降低,使無氧呼吸增強,積累了乙醛、乙醇等有毒物質(zhì),同時高溫下蛋白質(zhì)分解大于合成,形成大量游離氨氣毒害細胞;(3)高溫使細胞產(chǎn)生的水解酶類和溶酶體破裂放出的水解酶類使蛋白質(zhì)分解,同時由于氧化磷酸化解偶聯(lián),三磷酸腺苷(ATP)減少,蛋白質(zhì)合成受阻。此外,高溫破壞了核糖體與核酸的生物活性。因此,牧草植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降,代謝紊亂,植物生長不良,引起嚴重的傷害[35]。

5 預(yù)防黑麥草高溫脅迫的措施

5.1 培育和選用合適品種

根據(jù)不同地區(qū)的具體氣候條件和黑麥草的抗逆基因遺傳潛勢,有目的的引種和配需具有較強溫度脅迫抗性的良種,是最經(jīng)濟有效的方法。通過雜交、輻射等育種手段與野生種的選育均能得到抗熱性較好的草種。常規(guī)育種和生物技術(shù)育種相結(jié)合可選育優(yōu)良的黑麥草牧用品種。

5.2 噴施生長調(diào)節(jié)劑

利用植物生長調(diào)節(jié)劑可以提高黑麥草的抗熱性,并安全越夏。具體應(yīng)用時要注意兩點:一是選擇合適的藥劑類型;二是適宜濃度。施用化學(xué)物質(zhì)如多效唑(PP333)可提高植物的抗熱性。熊作明等采用不同濃度的 PP333噴施多年生黑麥草,觀察到各處理較對照均顯著減緩了出葉速度,增加了游離脯氨酸積累量、葉片相對含水量和可溶性蛋白含量,提高了抗壞血酸、過氧化物酶和硝酸還原酶活性[15]。

5.3 進行抗熱鍛煉

許多試驗已經(jīng)證明,抗熱鍛煉是提高黑麥草抗熱性能的一種有效的方法。徐勝等通過對多年生黑麥草熱鍛煉預(yù)處理,顯著緩減了高溫條件下黑麥草葉片膜脂過氧化程度的加劇,降低了葉片過氧化氫和超氧陰離子的產(chǎn)生速率[36]。

6 干旱對黑麥草的影響

水是植物體的重要組成部分,無論是長期的干旱還是短時間的水分虧缺都會給植物的生長發(fā)育帶來不利甚至有害的影響,天然草原和人工草地常因年度或季節(jié)性缺水而降低其產(chǎn)草量[37]。汝紅等通過試驗在不同的干旱脅迫下,黑麥草幼苗葉片中的過氧化氫酶活性和脯氨酸含量均隨脅迫時間的延長而增加[38]。鄭敏娜等利用透射電鏡技術(shù),研究了水分脅迫下多年生黑麥草葉肉細胞葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化,受傷害嚴重的葉綠體中的基粒和被膜破損,線粒體數(shù)目增加且對水分脅迫的耐受性強于葉綠體[39]。

根據(jù)前人的研究得出,抗旱性強的品種葉片保水力強,葉綠素含量高,游離脯氨酸維持積累時間長且累積量較高,并能保持相對較高的細胞膜完整性。石永紅等通過試驗經(jīng)抗旱性綜合評價得出,6個黑麥草品種抗旱性強弱依次為:愛神特>首相>百舸>頂峰>卡特>球道[40]。董超等對黑麥草進行試驗結(jié)果顯示:3個黑麥草品種抗旱能力表現(xiàn)為頂峰>VNS>耐特[41]。

7 黑麥草抗旱性的鑒定指標和鑒定方法

7.1 黑麥草抗旱性的鑒定指標

(1)種子萌發(fā)期的抗旱指標:相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和根系長度等。

(2)苗期的抗旱指標:葉片相對含水量、細胞膜相對透性、游離脯氨酸、葉綠素、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及丙二醛含量等。

7.2 黑麥草抗旱性的鑒定方法

黑麥草的抗旱鑒定主要應(yīng)用生理生化指標測定法。植物在受到水分脅迫后,抵御適應(yīng)干旱的途徑和方式多種多樣,因而用單一或個別生理生化指標難以進行復(fù)雜的抗旱鑒定,應(yīng)采用多項指標進行綜合評價。石永紅等通過試驗對 6個多年生黑麥草相對含水量、細胞膜相對透性、游離脯氨酸、葉綠素、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及丙二醛含量等抗性生理生化指標進行測定,并對其抗旱性進行綜合評價[40]。

8 黑麥草水分脅迫抗性的機理

植物的抗旱性是指植物通過一定的抗旱方式在長期干旱脅迫狀況下生存的能力,是一個受多因素控制的并且非常復(fù)雜的性狀,各因素之間往往還有交叉作用。植物抵御或適應(yīng)干旱的途徑通常有兩種,一是避旱;二是耐旱[42]。干旱脅迫對牧草的形態(tài)結(jié)構(gòu)和物質(zhì)代謝都產(chǎn)生很大影響。

8.1 氣孔調(diào)控

植物水分脅迫時,可以通過關(guān)閉氣孔來減少蒸騰失水。氣孔進行周期性運動時,氣孔口保持在較小的開度水平,能有效減少水分蒸騰散失,同時又保持足夠的吸收,調(diào)整CO2吸收和水分散失之間的平衡,從而使水分利用最佳化[42]。

8.2 滲透調(diào)節(jié)

滲透調(diào)節(jié)作為植物適應(yīng)干旱脅迫的重要生理機制,已成為抗旱生理研究最活躍的領(lǐng)域[43]。干旱下植物體內(nèi)游離氨基酸累積,包括脯氨酸和其他各種游離氨基酸和酰胺,對降低滲透勢均有一定的貢獻,其中,又以脯氨酸最重要[44]。

8.3 抗氧化防御系統(tǒng)

人們對干旱脅迫下植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)進行了研究,取得了大量的研究成果?？寡趸到y(tǒng)是由一些能清除活性氧的酶類和抗氧化物質(zhì)組成,如超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸等。單一的抗氧化酶或抗氧化物不足以防御這種氧化脅迫。因此,它們往往協(xié)同抵抗干旱脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害,如 SOD催化2個超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)形成 O2和 H2O2,再被POD和 CAT催化除掉。一般來講,干旱脅迫下植物體內(nèi) SOD等酶的活性與植物抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)?？购敌詮姷闹参?在干旱脅迫下,SOD,POD和 CAT的活性較高,能有效地清除活性氧,阻抑膜脂過氧化,因而抗旱性強的植物膜脂過氧化水平較低[45]。

9 提高黑麥草抗旱性的措施

9.1 培育和選用合適品種

根據(jù)不同地區(qū)的具體氣候條件和黑麥草的抗逆基因遺傳潛勢,通過雜交、輻射等育種手段與野生種的選育均能得到抗旱性較好的草種。常規(guī)育種和生物技術(shù)育種相結(jié)合可選育優(yōu)良的黑麥草牧用品種。楊鳳萍等應(yīng)用生物技術(shù)進行試驗研究,結(jié)果表明,利用逆境誘導(dǎo)型啟動子(rd29B)來調(diào)控外源 CBF1基因的表達能顯著改良黑麥草的抗旱能力[46]。

9.2 栽培措施

在干旱脅迫下,黑麥草的根系吸水功能受阻,增加根冠比可以彌補根系的吸水功能。脯氨酸是一種理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),在干旱時可以與蛋白質(zhì)分子上的疏水基作用,擴大親水基的表面,從而保護細胞膜結(jié)構(gòu)[47]。焦晉川等通過試驗研究采用不同濃度的鉀肥對多年生黑麥草進行處理,結(jié)果顯示干旱環(huán)境下一定濃度的鉀肥能顯著促進種子發(fā)芽率、增大葉片厚度和根冠比,從而提高多年生黑麥草的抗旱能力[48]。

9.3 噴施生長調(diào)節(jié)劑

近年來,有關(guān)烯效唑在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的研究越來越多,如降低植株高度、促進分蘗、提高抗逆性等[49～52]。但是關(guān)于烯效唑提高黑麥草抗旱生理機制的研究報道較少[53,54]。馬艷華等通過不同質(zhì)量濃度烯效唑?qū)邴湶葸M行試驗研究結(jié)果顯示,在進行干旱脅迫前,葉面噴施烯效唑,能夠在黑麥草受到干旱脅迫時不同程度的提高黑麥草的抗旱性[55]。高景慧等通過試驗采用聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)浸種及葉面噴施多效唑處理多年生黑麥草,綜合效應(yīng)表明,2%PVA浸種預(yù)處理+葉面噴施150 mg/m2多效唑處理能有效減輕水分匱乏對幼苗的脅迫并延緩植株生長[56]。

9.4 聚乙二醇(PEG-6000)對黑麥草抗旱性的影響

用 PEG-6000溶液模擬干旱脅迫是抗旱育種研究比較實用的方法。近年來,一些研究者已經(jīng)采用水稻、老芒麥等植物運用 PEG-6000溶液模擬干旱脅迫研究植物的抗旱機制[57,58],但是關(guān)于用聚乙二醇(PEG-6000)處理種子來比較黑麥草抗旱能力方面的研究還鮮見報道。萬里強等利用不同濃度 PEG-6000溶液對多年生黑麥草品種進行不同程度的水分脅迫處理和葉片生理生化指標響應(yīng),結(jié)果表明:PEG脅迫處理下品種“首相”對滲透脅迫的抗性最強,品種“歐必克”的抗旱性最強,而“鳳凰”的抗旱性最弱[59,60]。

10 問題與展望

我國黑麥草育種起步晚,主要是通過從國外引進優(yōu)良品種,在國內(nèi)進行遺傳改良從而加速黑麥草的育種進程。黑麥草作為一種重要的牧草資源,在推動我國畜牧業(yè)的發(fā)展中起到了一定的作用。由于黑麥草抗干旱、高溫等抗逆性較差,因而限制了在我國范圍內(nèi)大規(guī)模的栽培。 2010年我國西南各省遭受特大旱災(zāi),云南各地區(qū)和貴州西部等重旱區(qū)降水較少,抗旱育種迫在眉睫。

黑麥草是異花授粉作物,具有自交高度不親和性。轉(zhuǎn)基因育種在彌補傳統(tǒng)育種不足的同時也帶來了一些問題。基因工程并非是解決一切問題的萬全之策,通過植物基因工程得到的只是一種人工種質(zhì)新材料,而不是生產(chǎn)上可以立即應(yīng)用的新品種,它必須經(jīng)過常規(guī)育種考驗。只有將傳統(tǒng)的抗蟲、抗除草劑育種與遺傳工程及田間綜合防治相互結(jié)合起來,才能更好地控制害蟲和雜草的發(fā)生,更好地改良植物。因此植物基因工程技術(shù)必須與常規(guī)育種相結(jié)合,并經(jīng)大田試驗將轉(zhuǎn)基因植物的外源目的基因持續(xù)遺傳給后代或通過有性繁殖轉(zhuǎn)移到其他品種上去。為了糧食安全和生態(tài)環(huán)境的保護,黑麥草的抗熱和抗旱育種將為人類的可持續(xù)發(fā)展貢獻一份微薄力量。

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