奶牛乳腺炎抗性候選基因多態(tài)性研究進展

魏 偉，苗永旺

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南 昆明650201）

隨著人們生活水平的提高，奶制品以及加工工藝對原料奶質(zhì)量要求的提高，使得在使用抗生素治療奶牛乳腺炎時造成牛奶中抗生素殘留問題越來越突出；另外，隨著奶牛向高產(chǎn)奶量方向選育，奶牛乳腺炎發(fā)病率也越來越高。因此，如何通過藥物預防和治療奶牛乳腺炎，如何減少牛奶中藥物殘留等方面，這些并不能從根本上解決奶牛乳腺炎發(fā)病率高的問題。而對奶牛乳腺炎抗性候選基因的研究，選育出抗乳腺炎奶牛品種，這才是降低奶牛乳腺炎發(fā)病率的根本所在［1］。

乳腺炎（mastitis）是一種在奶牛業(yè)中多發(fā)的并且極其復雜的疾病，想通過一種單一方法去防治奶牛乳腺炎，效果并不理想?，F(xiàn)在乳腺炎仍然是奶牛群中花費最多的一種疾病，在美國將近要花費20億美元用來預防乳腺炎和提高奶產(chǎn)品的質(zhì)量，日本將進花費690億日元［2］。Shook［3］報道，奶牛乳腺炎遺傳力僅為0.02～0.04。可見其遺傳力較低，因此，對奶牛乳腺炎性狀進行直接選擇的標準性很小。近年來，隨著是基因組學和生物信息學迅速發(fā)展，為乳腺炎抗病育種提供了新方法，尤其是現(xiàn)在基因芯片的廣泛使用及不同組織器官轉錄組深入研究，為奶牛乳腺炎抗病育種提供了新的前景。本文就奶牛乳腺炎抗性候選基因研究進展作一綜述。

1 牛鋅指蛋白313（Znf313）基因

鋅指蛋白基因家族是一個巨大的超基因家族。鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，在基因的表達調(diào)控、細胞分化等方面起重要的作用。

Znf313基因是鋅指蛋白家族的成員，參與基因表達調(diào)控。曹隨忠等［4］利用一個患乳腺炎奶牛外周血白細胞中差異表達的EST序列，采用了電子克隆和分子生物學實驗技術相結合的方法，克隆了一個與奶牛乳腺炎抗性相關的基因cDNA編碼序列，并將該基因被命名為鋅指蛋白313基因，其開放閱讀框架1～639bp，推測其編碼230個氨基酸。他們還將克隆的Znf313基因推測的編碼氨基酸序列與人和豬的Znf313基因編碼氨基酸序列進行比較，相似性為95%和94%，揭示牛Znf313基因與人和豬Znf313基因具有相似的生物學功能。Ma等［5］克隆了人Znf313基因并研究了其生物學功能，結果表明人Znf313基因參與細胞分化。該基因在水牛上還沒有相關的報道，有待于進一步研究。

2 前腦鋅指蛋白基因

前腦鋅指蛋白（forebrain embryonic zinc finger－like，F(xiàn)EZL）是鋅指蛋白基因家族中的成員，作為轉錄因子在動物的神經(jīng)發(fā)育中起重要的作用，主要調(diào)控單胺能（monoaminergic）的神經(jīng)細胞的發(fā)育和機體的先天性免疫。

Sugimoto等［2］研究證明奶牛乳腺炎能夠誘發(fā)乳腺中FEZL的表達，而FEZL能促進SEMA5A的表達。SEMA5A表達量的提高能夠誘發(fā)與宿主免疫反應相關的至少九個基因的表達，包括TNF－α和IL－8。通過測序對比，易感乳腺炎型個體的FEZL序列與抗乳腺炎型個體的FEZL基因序列差異只是存在一個三個堿基的插入突變，導致FEZL氨基乙酸鏈長由12變成13。因為FEZL氨基乙酸鏈的長度影響它的轉錄活性，從而控制細胞因子的表達。隨后Sugimoto等［6］研究發(fā)現(xiàn)通過育種值估計來評價體細胞評分（somatic cell score，SCS），攜帶雜合12G的公畜的SCS明顯要低于攜帶純合的13G公畜，因此選擇攜帶雜合12G的公畜可以減少乳腺炎的發(fā)病率。該基因在黃牛上有研究，水牛上還沒有相關報道。

3 TLR4基因

TLR4（toll－like receptor 4）是 TLRs（toll－like receptors）家族的重要成員之一，屬于I型跨膜蛋白，該蛋白胞外區(qū)高度變異，以適應不同配體分子的需要，胞內(nèi)區(qū)卻很保守，以便維持信號轉導活性的需要［7］。牛 TLR4基因位于牛的8號染色體上［8］，全長11Kb，在機體炎癥反應啟動和病原微生物的免疫應答中發(fā)揮著重要的作用。

王興平等［9］采用 CRS－PCR（create restricti on site combined with restriction fragment length polymorphism）方法擴增了奶牛TLR4基因第三外顯子243bp的目的片段，通過限制性內(nèi)切酶Hinf I酶切篩查多態(tài)位點，發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物27bp處C－T突變造成編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，結果表明AA基因型為乳腺炎抗性基因型，A等位基因為乳腺炎抗性有利基因。劉文嬌等［10］采用PCR－RFLP（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism）方法對奶牛TLR4基因第三外顯子321bp的部分序列進行多態(tài)性分析，通過限制性內(nèi)切酶Bbv12I酶切篩查多態(tài)位點，C－T突變導致編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔Y果表明不同基因型奶牛的SCS表現(xiàn)出CC基因型＞CT基因型＞TT基因型的趨勢。該基因在水牛上有相關的研究，但只有該基因的核苷酸序列。

4 TLR2基因

TLR2（toll－like receptor 2）是 TLRs家族中的第2個成員，能夠識別多種病原微生物及其產(chǎn)物，介導天然免疫，通過細胞內(nèi)信號轉導，啟動獲得性免疫。牛TLR2基因被定位在17號染色體上［8］。

Petzl等［11］對14頭未感染乳腺炎的奶牛乳腺接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，通過實時定量PCR（Real－time Quantity PCR）檢測，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌侵染后可顯著增加TLR2、TLR4以及β－防御素（β－defensin）的表達，而接種金黃色葡萄球菌后可顯著增加β－防御素的表達。白杰等［12］對TLR2基因編碼區(qū)進行測序，在第二外顯子發(fā)現(xiàn)3個SNPs，然后對這3個SNPs進行PCR－RFLP檢測，結果揭示189、631位點的SNP對奶牛的SCS有較大影響，而2260位點的SNP可能會提高奶牛的SCS。

5 乳鐵蛋白基因

乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是保護乳腺組織的防御因子之一，屬于轉鐵蛋白家族［13］，具有廣譜的抗菌作用。編碼乳鐵蛋白的基因被定位在22號染色體上，而且乳鐵蛋白濃度能被遺傳（h2＝0.4）［14］，其含量和乳腺炎的發(fā)生存在相關性，并發(fā)現(xiàn)在復原的乳腺組織內(nèi)Lf能極大地阻止葡萄球菌和大腸桿菌生長。

Diarra［15］認 為，N－乙 酰－β－D－氨 基 葡 萄 糖 苷 酶（N－acetyl－β－D－glucosaminidase，NAGase）不僅僅可以作為乳腺炎檢測的一個指標，而且該酶還具有一定的免疫活性，通過與Lf協(xié)同作用，能夠抑制某些病原微生物的活性。因此，從生理作用、蛋白質(zhì)結構到表達等各個水平深人研究NAGase在乳腺炎發(fā)生中的作用，對研究奶牛乳腺炎的檢測、治療乃至乳腺炎抗性的遺傳選育等都具有重大意義。王洪梅等［16］采用 PCR－RFLP、CRS－PCR 方法研究了中國荷斯坦牛Lf基因的啟動子區(qū)，結果表明Lf基因啟動子區(qū)72位的AB基因型和478位的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的優(yōu)良基因型，可作為分子標記應用于奶牛乳腺炎抗性篩選。

6 趨化因子受體基因

趨化因子（chemokine）是指一類能夠趨化細胞定向移動的小分子分泌蛋白。趨化因子受體屬于G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體家族［17］，大小一般由350～360個氨基酸組成。趨化因子通過與受體的結合，對免疫細胞在體內(nèi)的遷移、活化和分布起重要作用，并參與免疫應答的調(diào)控，與機體抵抗感染（如HIV感染）等密切相關。

牛CXCR1基因被定位在2號染色體距著絲粒約90.3cM 處，其 mRNA 全長是1083bp［18］。陳仁金等［18］采用PCR－SSCP方法研究了CXCR1基因的5＇側翼區(qū)和編碼區(qū)進行多態(tài)性檢測，研究結果發(fā)現(xiàn)1830（A/G）位點AA基因型、1768（T/A）位點TT基因型和344（T/C）位點TT基因型以及根據(jù)發(fā)現(xiàn)的4個SNPs預測的10種單倍型中單倍型Haplo2（ATTA）純合體對中國荷斯坦牛的SCS具有較大的遺傳效應，可作為分子標記應用于奶牛乳腺炎抗性的篩選。

當牛乳房發(fā)炎時，嗜中性粒細胞將從血液中遷移到病菌感染處，通過與其受體結合吞噬病原體。研究表明，CXCR2基因多態(tài)性與牛的臨床和亞臨床性乳腺炎對疾病敏感性相關［19］。Younggerman等［20］研究了CXCR2基因的777位的SNP與乳腺炎抗性之間的關系，777位SNP基因型和隱性乳腺炎的表達顯著相關。劉文嬌等［21］采用測序技術對CXCR2基因編碼區(qū)進行了多態(tài)性篩查，結果發(fā)現(xiàn)在612位、684位、777位、855位、858位和861位有6個SNPs，其中612位和777位SNPs可作為奶牛乳腺炎抗性分子標記位點。該基因在水牛上沒有相關研究報道。

7 熱休克蛋白70

熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）作為蛋白成熟過程中的分子伴侶通過分子伴侶作用參與新生蛋白質(zhì)折疊、轉運、損傷蛋白質(zhì)的修復和抗原呈遞等許多重要體內(nèi)過程，其表達能夠減少NO的合成釋放，減輕炎癥因子對細胞的損傷。牛的HSP70由HSP70－1和 HSP70－2這兩個基因編碼，都被定位在染色體23q13。程維杰等［22］采用PCRSSCP和PCR－RFLP方法研究了中國荷斯坦奶牛HSP70－1基因編碼區(qū)的多態(tài)性及其與中國荷斯坦牛SCS的相關性，研究發(fā)現(xiàn)1623位點和2409位點2個SNPs，1623位點基因型與SCS相關性顯著（P＜0.05），2409位點基因型與SCS相關性不顯著（P＞0.05），CC基因型可作為改良奶牛乳腺炎抗性性狀的分子遺傳標記。該基因在水牛上也沒有相關研究報道。

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