熊果酸聯(lián)合供者特異性淋巴細(xì)胞輸注誘導(dǎo)小鼠免疫耐受

劉勇 李堯 黃霞 李超 薛承彪 胡昕鵬 楊濤 周平

核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是 T 細(xì)胞活化重要信號(hào)分子。我們前期研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞特異性 NF-κB 活化障礙小鼠——IκBαΔN-Tg 小鼠，能夠永久接受異基因心臟移植物。本研究將探討以NF-κB為干預(yù)靶點(diǎn)的小分子化合物——熊果酸對(duì)小鼠異基因心臟移植的影響。

實(shí)驗(yàn)方法如下:(1)流式細(xì)胞術(shù)分選獲取C57BL/6(B6)脾臟T細(xì)胞并于體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3組:對(duì)照組僅加入T細(xì)胞;單克隆抗體(簡稱單抗)刺激組同時(shí)加入2 μg/mL抗CD3單抗和1 μg/mL抗CD28單抗;單抗刺激+熊果酸組在加入單抗前將 T 細(xì)胞與5、10、25 μmol熊果酸各孵育2 h。單抗刺激24 h后檢測(cè)p65核轉(zhuǎn)位程度，48 h后檢測(cè)T細(xì)胞表面CD25、CD69表達(dá)以及培養(yǎng)上清液中IL-2水平。(2)建立BALB/c到B6或RAG-/-(T細(xì)胞和B細(xì)胞缺陷)的腹部心臟移植模型。分為5組:空白對(duì)照組僅行心臟移植;溶劑對(duì)照組使用0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃;供者特異性淋巴細(xì)胞輸注(donor specific transfusion，DST)組在移植成功后立即給予DST(1.0×107BALB/c脾臟細(xì)胞，自眼球后輸入);熊果酸組自術(shù)前1 d至術(shù)后14 d每天給予20 mg/kg熊果酸灌胃;熊果酸聯(lián)合DST組采用前述兩種措施。(3)二次心臟移植。采用頸部心臟移植，受體為移植心臟長期存活小鼠(long time survival，LTS)，供體分別為BALB/c和C3H小鼠。(4)過繼輸注。1×107B6脾臟細(xì)胞、1×107LTS脾臟細(xì)胞、1×107B6脾臟細(xì)胞+1×107LTS脾臟細(xì)胞分別輸注給移植了BALB/c心臟的RAG-/-小鼠;1×107排斥了BALB/c移植心臟的B6小鼠(簡稱Rej)脾臟細(xì)胞輸注給移植了BALB/c心臟的RAG-/-小鼠和LTS。(5)術(shù)后觀察。每天捫診心臟，觀測(cè)移植心臟存活時(shí)間;檢測(cè)術(shù)后7 d LTS脾臟細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例;INF-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)不同抗原的反應(yīng)性。

結(jié)果:(1)單抗刺激24 h后T細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 上升，而 5、10、25 μmol的熊果酸分別將其下調(diào)。48 h后25 μmol的熊果酸將單抗刺激后T細(xì)胞表面CD25下調(diào)92.4%，CD69下調(diào)89.3%;上清液中 IL-2 濃度上升，5、10、25 μmol的熊果酸分別將其下調(diào)。(2)移植心臟平均存活時(shí)間空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組相似，DST組延長，20 mg/kg熊果酸可將其延長至(36.8±0.6)d，熊果酸聯(lián)合 DST可使84.6%的移植心臟存活超過150 d。(3)二次心臟移植時(shí)，LTS可持續(xù)(＞100 d)不排斥BALB/c心臟，而在14 d內(nèi)排斥C3H心臟。LTS脾臟細(xì)胞對(duì)C3H抗原反應(yīng)正常，而對(duì)BALB/c抗原反應(yīng)降低。術(shù)后7 d時(shí)脾臟中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例熊果酸聯(lián)合DST組與LTS相似。排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間聯(lián)合移植LTS和B6脾臟細(xì)胞與單純輸注B6脾臟細(xì)胞無明顯差異，LTS接受Rej脾臟細(xì)胞后與RAG-/-小鼠輸注Rej脾臟細(xì)胞后也無明顯差異。

綜上結(jié)果，熊果酸可劑量依賴性地抑制抗CD3、CD28單抗促發(fā)的T細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位和T細(xì)胞活化。短期應(yīng)用熊果酸輔以手術(shù)當(dāng)天DST能誘導(dǎo)供者特異性小鼠移植心臟免疫耐受，而CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞作用及其他調(diào)節(jié)機(jī)制并非該耐受模型的主要機(jī)制。

相關(guān)研究 Ursolic acid promotes robust tolerance to cardiac allografts in mice由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所周平(pzhou@tjh.tjmu.edu.cn)團(tuán)隊(duì)完成，全文將發(fā)表于Clinical and Experimental Immunology 2011年第2期。