血管內(nèi)皮抑素抑制淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用機制

馬興群 宋 勇

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志之一，越來越多的證據(jù)認(rèn)為腫瘤新生淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有密切關(guān)系。了解調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成的信號通路，有可能成為抑制腫瘤生長的新方法。近年來，陸續(xù)有報道認(rèn)為血管內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)有抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，但其機制尚未完全明確。現(xiàn)將相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

一、腫瘤新生淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在腫瘤研究中被忽視的原因

腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是多數(shù)腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制很多，包括腫瘤細(xì)胞侵犯局部組織、淋巴道轉(zhuǎn)移、血行播散等。長期的臨床和病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，淋巴管道轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞發(fā)生播散的主要途徑［1］。伴有多發(fā)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinomas，SCCs)患者，5年生存時間與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較，分別是26%和75%［2］。新生淋巴管形成常在胚胎期、組織損傷、炎癥、寄生蟲感染、腫瘤等情況下發(fā)生［3］。過去10年中對腫瘤新生血管形成的分子機制有了深入的研究，而對淋巴管形成和轉(zhuǎn)移在腫瘤中的重要作用一直被忽視，其原因之一可能是缺乏特異性分子標(biāo)志物來區(qū)分血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，其次，對調(diào)節(jié)淋巴管生長的特異性生長因子也缺乏了解［1，4］。

二、淋巴管結(jié)構(gòu)以及晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)表面的細(xì)胞因子及受體

淋巴管尾端是個盲端結(jié)構(gòu)，表面被覆單層內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞之間有不規(guī)則間隙，孔隙較大，細(xì)胞間連接和緊密連接稀疏分布。毛細(xì)血管被覆雙層內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞間密布緊密連接，循環(huán)周細(xì)胞豐富，而起始淋巴管的周細(xì)胞分布較少或者缺如，細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞骨架借助彈性蛋白絲與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相連［5］。透明質(zhì)酸(hyaluronan，HA)是ECM的主要成分之一，HA與白細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞表面的CD44跨膜受體相互作用，為白細(xì)胞遷移和腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供通道［6］。在LECs表面有特異性分子標(biāo)志物:淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體抗體LYVE-1(lymphatic vessel endothelial HA receptor)，調(diào)控早期淋巴管生成的同源基因Prox-1及腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白受體podoplanin［3-4］。LYVE-1是最近發(fā)現(xiàn)的HA受體，僅在LECs上有高度表達(dá)，參與淋巴細(xì)胞歸巢和腫瘤細(xì)胞遷移。分子結(jié)構(gòu)與CD44高度相似，但是CD44分子在LECs幾乎沒有表達(dá)，因LYVE-1與CD44功能相似，能與可溶性和不可溶性的HA結(jié)合，用免疫電子顯微鏡檢查，LYVE-1的管腔結(jié)構(gòu)具有淋巴管的超微結(jié)構(gòu)特征，LYVE-1是目前罕為人知的淋巴管特異性分子標(biāo)志物之一［6］。此外，在LECs表面有VEGF-C的表達(dá)，該因子是VEGF家族中的成員之一，能激活VEGFR-3［4］。開放的細(xì)胞連接和淋巴微孔是腫瘤細(xì)胞入侵的門戶，腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)新生淋巴管生成。既往認(rèn)為只有在腫瘤原發(fā)部位和癌旁會有新生淋巴管形成，即腫瘤誘導(dǎo)新生淋巴管(tumoral lymphangiogenesis)形成。腫瘤細(xì)胞是以滲透或者栓子形式，通過體內(nèi)已經(jīng)存在的成熟淋巴管達(dá)到前哨淋巴結(jié)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而并不是通過新生淋巴管道轉(zhuǎn)移的。近年發(fā)現(xiàn)在區(qū)域淋巴結(jié)尤其是被腫瘤細(xì)胞侵犯的前哨淋巴結(jié)附近也有新生淋巴管形成，這一現(xiàn)象被稱為淋巴結(jié)誘導(dǎo)淋巴管形成(lymph node lymphangiogenesis)。這些淋巴管不斷生長并為各級淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供額外通道，新生淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相輔相成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］。類似于血管生成調(diào)節(jié)方式，淋巴管生成也受到淋巴管生成因子以及淋巴管生成抑制因子的精細(xì)調(diào)控。LECs表面有多種細(xì)胞因子及受體的表達(dá)，1996年Eola等［8］發(fā)現(xiàn)VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合，可能在淋巴管生成過程中起到調(diào)節(jié)作用。越來越多的實驗證明，VEGF-C是調(diào)節(jié)淋巴管生成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要因子［1，4，9］。腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)VEGF-C高表達(dá)，促進(jìn)淋巴管生成以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［1，4］。過表達(dá)VEGF-C的轉(zhuǎn)基因小鼠，對腫瘤原發(fā)灶增值的作用不明顯，但是卻顯著地增加前哨淋巴結(jié)附近的淋巴管增生，而野生型小鼠，不能誘導(dǎo)LECs從主靜脈發(fā)出以及淋巴管形成［3，4］。因此，抑制VEGF-C表達(dá)有可能達(dá)到抑制癌細(xì)胞經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而為輔助抗腫瘤治療提供新的治療方法。

三、ES抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的經(jīng)典分子機制

1997年O’Relly在鼠血管瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中分離得到的一種血管生成抑制因子，它可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，測序發(fā)現(xiàn)它是源于ⅩⅤⅢ膠原蛋白C-末端的水解片段，是以膠原蛋白ⅩⅤⅢ為前體切割而來，并命名為ES［10］。ES在多種腫瘤動物模型中能抑制腫瘤生長和血管生成，未出現(xiàn)毒性及耐藥性［11-12］。近年發(fā)現(xiàn)ES和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及淋巴管生成之間有密切聯(lián)系。Nikolaos等對315例1991年2月至1999年7月之間的SCCs原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組化，多發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N+)的SCCs原發(fā)病灶缺乏角化和淋巴細(xì)胞浸潤，細(xì)胞核呈高度多形性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移附近有絲分裂相明顯增加，ES蛋白和ⅩⅤⅢ膠原蛋白的表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯下調(diào)，ES蛋白在原發(fā)病灶和多發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的表達(dá)無明顯差異。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SCCs患者3年和5年生存期明顯延長，表皮角化程度較高［2］。這一研究結(jié)果提示ES可能有抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和新生淋巴管生成作用，并能改善SCCs的分化，提高角質(zhì)化程度。高表達(dá)ES的J4轉(zhuǎn)基因小鼠，與野生型小鼠相比，血清中ES含量高1.6倍，能明顯改善化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的皮膚癌分化，降低腫瘤惡性度和侵襲力。皮膚鱗狀細(xì)胞癌和良性乳頭狀瘤小鼠，在各不同時間點，LYVE-1+淋巴管密度都明顯降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著下降。第34周的乳頭狀瘤小鼠，VEGF-C的表達(dá)較對照組下降7倍，VEGFR-3含量下降15倍，而VEGF-A、VEGF-D、VEGFR-2的含量在兩組中無差異。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，被癌細(xì)胞侵入的肥大細(xì)胞能高表達(dá)VEGF-C，而這種細(xì)胞在同一分化級別的高表達(dá)ES的J4小鼠中分布很少。肥大細(xì)胞主要參與腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移過程，ES能特異性的抑制肥大細(xì)胞的這一過程，使VEGF-C的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制新生淋巴管生成，減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［13］。Shunsuke等［14］發(fā)現(xiàn)含有ES基因的腺病毒(Ad-end)轉(zhuǎn)染裸鼠后，Ad-end體外能抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和微管形成，體內(nèi)能抑制口腔原位移植瘤生長，與對照組相比，第23天，腫瘤體積被抑制2/3，淋巴管密度分別是(1.6 ± 1.1)個和(5.4 ± 1.3)個，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量分別是(0，5/5)和(100%，5/5)，同時腫大淋巴結(jié)數(shù)量明顯減少.免疫組化及蛋白印跡發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達(dá)明顯降低。Dong等［15］在實驗中發(fā)現(xiàn)，Lewis肺癌小鼠隨機分成2組分別給予恩度和生理鹽水處理 ，治療組腫瘤體積和轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量明顯減小，淋巴管密度明顯降低。發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)量明顯減少，VEGF-C的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.001)。賈漪濤等［16］對宮頸癌移植瘤裸鼠進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn)，恩度可以通過抑制裸鼠宮頸癌模型的血管和淋巴管生成，而抑制腫瘤的生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。大劑量恩度(20 mk/kg)+順鉑組、小劑量恩度(10 mg/kg)+順鉑組和恩度組(10 mk/kg)的腫瘤生長速度明顯慢于對照組和順鉑組(P＜0.05)。

四、ES抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤新生淋巴管生成的其他機制

近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ES通過其他分子機制抑制淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。ES的主要靶細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，ES是否會直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而抑制新生淋巴管形成?Yan等發(fā)現(xiàn)LECs表面有一種特異性受體——核仁素(nucleolin)，該受體選擇性表達(dá)在新生淋巴管LECs上，而在成熟淋巴管LECs表面無表達(dá)，ES能直接抑制LECs遷移、微管形成以及ERK信號通路的激活等，對正常淋巴管無影響，而中和細(xì)胞表面的核仁素或者將核仁素基因敲除后，ES的上述作用消失。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，PBS處理組的B16/F10黑色素瘤小鼠，廣泛出現(xiàn)腋下和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，ES處理組則淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)明顯降低，而ES聯(lián)合抗核仁素抗體組則同樣出現(xiàn)腋下和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，即ES的存在不能翻轉(zhuǎn)抗核仁素抗體的抑制效應(yīng)，兩組淋巴管podoplanin染色和LYVE-1都出現(xiàn)陽性，同時核仁素在兩組新生淋巴管上都有高表達(dá)，而在正常小鼠LYVE-1陽性的皮膚、結(jié)直腸和淋巴結(jié)等處都未見有核仁素表達(dá)。乳腺癌小鼠模型中，腋下和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在抗核仁素抗體組和ES聯(lián)合抗核仁素抗體組之間無明顯差別;而在乳腺癌肝臟轉(zhuǎn)移實驗?zāi)Ｐ椭校购巳仕乜贵w能抵消ES抑制肝臟微轉(zhuǎn)移灶形成的效應(yīng)。上述實驗?zāi)Ｐ吞崾綞S可能是在LECs表面的核仁素受體介導(dǎo)下抑制新生淋巴管形成，并抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［16］。

纖維連接蛋白選擇性胞外區(qū)域A(extra domain A，EDA)是結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的促淋巴管形成因子。整合素a9(integrin a9)也是淋巴管形成調(diào)節(jié)因子之一，可與VEGF-C/D結(jié)合，激活VEGF信號傳導(dǎo)通路。Hou等在結(jié)腸癌SW480小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，EDA是integrin a9的配體，二者形成復(fù)合物，共同定位於LECs表面，促進(jìn)結(jié)腸癌新生淋巴管的形成。ES顯著抑制EDA-integrin a9復(fù)合物在LECs上表達(dá)，ES 20ng/ml處理后該復(fù)合物表達(dá)出現(xiàn)明顯的下降趨勢，ES 40ng/ml時該復(fù)合物的表達(dá)即消失。近一步研究發(fā)現(xiàn)，ES能導(dǎo)致LECs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞、極性改變和重排，抑制淋巴微管結(jié)構(gòu)形成［17］。

五、ES抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成的臨床應(yīng)用

惡性胸腔積液產(chǎn)生的原因，歸納起來可以包括兩點:①腫瘤新生血管的生成，增加了毛細(xì)血管網(wǎng)的滲透面積，兩者共同作用引起血管滲透性增加;②腫瘤細(xì)胞阻塞了淋巴管，增加了淋巴液流體靜壓，使淋巴回流受阻，因而水和蛋白質(zhì)吸收減少，潴留于漿膜腔內(nèi)［18］。Jiang等［19］在實驗發(fā)現(xiàn)，重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)經(jīng)腹腔內(nèi)注射治療小鼠腹腔積液，能明顯地降低小鼠腹膜的滲透性，顯著減少實驗小鼠腹水中VEGF水平，其中以恩度8 mg/kg和16 mg/kg劑量腔內(nèi)注射治療腹水效果最佳。Fang等［20］在Ad-end轉(zhuǎn)染實驗小鼠胸腔積液模型中發(fā)現(xiàn)，ES能抑制胸膜新生血管形成、降低胸膜血管通透性，抑制胸腔積液和胸膜轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)形成等作用。ES能治療漿膜腔積液，除考慮與降低血管通透性，抑制積液形成有關(guān)外，可能與抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，通暢淋巴引流，促進(jìn)積液排泄等過程中有重要關(guān)系。即一方面降低新生血管通透性，減少積液形成，另一方面減少腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，減少淋巴管阻塞，通暢引流，在來源和去路兩個方向產(chǎn)生作用。當(dāng)然，上述實驗未對胸膜或者腹膜進(jìn)行淋巴管染色和HE染色，，淋巴管的管腔結(jié)構(gòu)是否發(fā)生相應(yīng)變化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率是否下降等有待于后續(xù)實驗進(jìn)一步證實。

上述研究提示ES主要通過下調(diào)VEGF-C的表達(dá)，抑制淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這一通路被認(rèn)為是經(jīng)典途徑。目前ES抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究主要集中在鱗狀細(xì)胞癌和肺癌等腫瘤模型中，原因可能是在這類腫瘤中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比血行播散更重要，而傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等方法尚不能達(dá)到完全抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。除了下調(diào)細(xì)胞因子外，ES還直接作用于LECs表面的相關(guān)受體，抑制新生淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有相輔相成的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。ES能抑制淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無疑對“抗血管生成治療腫瘤”這一傳統(tǒng)方案是錦上添花，未來我們努力的方向，應(yīng)該是加強ES抑制腫瘤形成和轉(zhuǎn)移機制的更深入了解，構(gòu)建合理的基因治療載體，以及聯(lián)合放、化療等多種治療方案上，更好的提高腫瘤患者的生活質(zhì)量。

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