硫酸軟骨素在促進成骨中的研究與應用

任光輝 徐 欣

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)是一種結構較復雜，硫酸化的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)是蛋白多糖(proteoglycan，PG)的重要組成成分，是由己糖羧酸和己糖氨基交替組成的帶有負電荷的直鏈碳水化合物，其分子結構主要由D-葡糖醛酸與2-乙酰氨基-2-脫氧-硫酸-D-半乳糖組成，相對分子質(zhì)量(M r)為(10-50)×103。根據(jù)硫酸基在N-乙?；?D-氨基半乳糖的不同位置，可分為硫酸軟骨素A(CS-A)、硫酸軟骨素C(CS-C)、硫酸軟骨素D(CS-D)等不同異構體[1]。硫酸軟骨素的功能主要通過所組成的蛋白聚糖來體現(xiàn)，大致分為結構功能和調(diào)節(jié)功能，其分子中含有多個硫酸基和羧基，故呈酸性，可與鈉、鉀、鈣離子等結合成鹽；可促進細胞粘附，提高骨組織的強度和韌性；可鍵合和調(diào)節(jié)細胞因子和生長因子，抑制蛋白酶分解，并且可影響細胞的粘附、遷移、增殖和分化，所以具有生物活性。CS用于體內(nèi)移植或注射，無炎癥或變態(tài)反應，在動物體內(nèi)可被降解為氨基葡糖參與代謝，長期服用毒副作用較低。商品CS是以健康動物(豬、牛、馬、羊和鯊魚等)軟骨、氣管或骨鍵、韌帶等為原料提取的一種重要的糖胺聚糖類藥物。在歐美和日本等國，CS主要作為保健食品和藥品，用于防治冠心病，心絞痛，心肌梗死，骨關節(jié)炎，角膜炎，耳聾耳鳴，神經(jīng)痛等疾病。

1.CS在促進骨組織生成中的作用

骨的生成是一系列的生物化學發(fā)展進程，可分為骨細胞增殖、細胞外基質(zhì)的聚集和骨組織礦化三個時期，通過細胞基質(zhì)的相互作用，細胞外基質(zhì)分子在組織生長和細胞分化過程中起著重要作用，而硫酸軟骨素是細胞外基質(zhì)分子的重要組成部分。

1.1 與TGF(轉移生長因子)的關系 在細胞外基質(zhì)中CS能與TGF(轉移生長因子)發(fā)生粘附，關于CS對TGF的調(diào)節(jié)作用還存在爭議，Yamakuchi等[2]認為TGF能刺激細胞分泌CS，但與TGF的結合競爭性地抑制TGF與受體的結合，因而抑制TGF的活性，CS在調(diào)節(jié)TGF的活性方面起負反饋的作用。但Takeuchi等[3]的研究卻證實CS增加TGF與受體的結合，這意味著CS增加TGF的活性。并且TGF能增加成骨細胞合成細胞外基質(zhì)(包括CS)的能力，因而在骨基質(zhì)蛋白尤其是CS與TGF間存在正反饋的相互作用，可推定CS能捕捉TGF和增加TG的活性，有效地促進成骨細胞分泌及加強對成骨細胞的影響。由于TGF多重生理特性，CS與TGF間的關系還可增加TGF對其他細胞的作用，在骨改建的過程中增加骨的形成。

1.2 CS調(diào)節(jié)細胞的作用 在細胞間的相互作用中，CS被看做是多用途的“黏合劑”，因其側鏈具有多樣性，使其能與多種分子相互作用[4]。能與細胞外基質(zhì)成分結合，調(diào)節(jié)細胞與基質(zhì)的結合，捕捉基質(zhì)和細胞表面的可溶性因子，如生長因子，以促進成骨細胞的成熟。

1.3 CS與細胞粘附的關系 它與不同的細胞外基質(zhì)分子、細胞-細胞粘附分子及生長因子的結合主要是依賴于其所帶的負電荷極性。由于與細胞外基質(zhì)分子的相互作用，細胞表面的蛋白多糖(proteoglycan，PG)能影響細胞的粘附[5]。細胞膜嵌入蛋白多糖，它帶有硫酸肝素和CS鏈，能與膠原和纖維粘連蛋白結合，從而調(diào)節(jié)細胞的粘附。

1.4 CS在骨組織鈣化過程中的影響 骨的礦化可被一系列的全身和局部因素影響，如激素水平，可利用的鈣和磷的量、細胞合成功能、糖蛋白、磷蛋白、基質(zhì)膠原、基質(zhì)小泡等，這些因素及其相互間的關系尚不清楚，但部分學者認為CS在骨的礦化過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。1935年Logan[6]觀察到軟骨轉變成骨的過程中伴隨著大量硫化成分的減少，認為無機鹽在基質(zhì)中的沉積依賴于CS，隨后Sylven[7]也贊同這個觀點并進一步強調(diào)CS的減少是軟骨礦化所必須的。一些生化分析顯示在礦化軟骨中PG含量減少。De jong[8]對豬肩胛軟骨的各個區(qū)域的分析得出礦化區(qū)的糖醛酸和氨基己糖含量最低，Lohmander[9]得出非礦化區(qū)的GAG含量比高度或局部礦化區(qū)域高近兩倍。

1.4.1 CS吸附鈣的能力 CS因由大量的帶負電荷的硫酸和羧酸基團，能吸引陽離子在其周圍聚集，已有一系列的的物理化學方法用來研究其與陽離子的粘附，但對粘附的方式存在爭議，Mukherjee[10]認為CS中只有羧基基團與鈣離子的吸附有關，McGregor[11]等認為CS中硫酸基團和羧酸基團在高濃度的鈣溶液中都參與與鈣的相互作用。進一步的研究認為，鈣離子與羧基基團有位點(特異性)粘附，而與硫酸基團只有靜電作用的粘附。HunterGK[12]還測定CS與鈣的親和力和粘附量，顯示CS與鈣的結合力很微弱(解離常數(shù)為14mM)，但有大的結合量(一個二糖單位約結合0.7個鈣離子)，這些粘附的參數(shù)可用來估計軟骨中粘附的鈣含量，為簡化起見，假設所有的GAG均為CS，血清中鈣的濃度為2.5mM，軟骨中CS的濃度為50 mg/ml，軟骨中粘附的鈣離子濃度為60 mM。由于其他陽離子的競爭(主要為NA+)[4]，且這種粘附力是微弱，鈣易被競爭性的置換出來為礦化所利用。CS所粘附的鈣離子為軟骨基質(zhì)的鈣化準備鈣的儲存庫。

1.4.2 CS在羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)形成中的作用 De jong[13]等泵動磷酸鈣溶液流經(jīng)聚丙烯酸膜來模擬體內(nèi)環(huán)境，在膜內(nèi)加入10 mg/mL的CS，結果增加磷酸鈣晶相的沉積，因此在鈣離子穩(wěn)定環(huán)境下，CS是HA形成的促進劑。

1.4.3 CS促進礦化的機制 CS所結合的鈣怎樣被礦化組織利用，以前的觀點是隨著PG的降解，它所結合的鈣被釋放出來，目前新的觀點認為CS中的鈣是被置換出來的。Paige等[14]認為在礦化基質(zhì)中存在離子交換，將軟骨浸于鈣溶液中，再浸入磷溶液中，組織基質(zhì)攝入兩種離子并有鈣化的沉積，將兩種反應順序顛倒，就無沉積的發(fā)生。Dilek[15]利用膠原-CS復合體得出相似的結論，恰當?shù)慕忉屖氢}離子與CS結合隨后又被磷置換出來，從而升高磷酸鈣的濃度積，超過沉積的閾值，同時CS吸附在膠原纖維表面為礦化提供成核位點，在這雙重作用下很容易產(chǎn)生礦化沉積。

1.4.4 CS加速骨創(chuàng)的愈合 Moss等[16]拔出犬下頜雙側尖牙，實驗組一側放入浸于CS溶液(5mg/mL)的明膠海綿，對側放入浸有生理鹽水的海綿，在早期實驗組比對照組有較多的新骨生成(4-6周)，而晚期實驗組與對照組在骨修復上無區(qū)別(8周以后)，因而認為CS能加速骨修復的速度而不能影響最終骨形成的質(zhì)和量。隋良朋等[17]將CS復合HA充填拔牙窩也加速拔牙窩的愈合，Masataka等[18]在尖周牙槽骨用根管擴銼造成缺損，用含CS的根充糊劑充填根管后發(fā)現(xiàn)含有CS的糊劑不僅可加速尖周骨質(zhì)的愈合，而且在促進尖周牙槽骨改建上有較大的作用。Pieper等[19]用膠原和CS的混合物來充填牙周病的兩壁袋骨缺損，發(fā)現(xiàn)膠原與CS的混合物能增多骨質(zhì)形成量，并使新生骨質(zhì)中的膠原排列的更有序。這些研究均表明CS有促進骨質(zhì)礦化的作用。

2.CS在骨組織工程中應用

有研究證實[20-22]，膠原-HA-CS支架在體內(nèi)的成骨能力好于膠原-HA支架。膠原-HA-CS人工骨的成骨速度、成骨范圍及Ⅰ型膠原分泌量均優(yōu)于膠原-HA人工骨。硫酸軟骨素的添加有利于誘導成骨細胞的生長、增殖和粘附，且改善的骨誘導形成蛋白(BMP)承載系統(tǒng)，使BMP能在組織局部聚集成較高的濃度，從而有利于新骨的形成。作為骨缺損的替代物，膠原-HA-CS人工骨的力學性能和生物性能均優(yōu)于膠原-HA人工骨。有研究[23]將以天然骨骼的3種基本成分—膠原、羥基磷灰石、硫酸軟骨素，復合構建成三維多孔支架體系，再吸附以具有骨誘導活性的細胞因子BMP-2，形成骨修復材料。通過體外細胞種植和體內(nèi)異位成骨，觀察其生物相容性和骨誘導能力，并結合一系列的理化性能實驗對其組成和結構進行分析。結果顯示，膠原-羥基磷灰石-硫酸軟骨素骨修復材料具有與天然骨類似的組成和微觀結構，適于細胞粘附生長，生物相容性好，通過和骨形態(tài)發(fā)生蛋白結合，具有骨誘導活性，可進一步用于骨組織的修復。

3.展望

CS作為一種資源豐富性能優(yōu)異的生物材料，因其特有的生物活性而廣泛用于醫(yī)學領域,被廣泛應用于生物醫(yī)學領域。作為組織工程材料，CS在骨、軟骨、皮膚、肝、神經(jīng)等組織均顯示出一定的應用潛力[24]，但都存在一些缺點和不足。例如，作為支架材料，其力學強度、降解速度及與宿主間的結合能力均有待提高和優(yōu)化。隨生物醫(yī)學領域和組織工程的發(fā)展，仿生材料的研究引起人們的關注。與基因治療相結合成為研究熱點。總之，CS在組織工程中的應用前景廣闊。硫酸軟骨素在其他方面的潛在應用有待開發(fā)。

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