耐高溫廚余垃圾降解菌的分離、馴化與應(yīng)用

陳海燕，宗 紅，陸信曜，諸葛斌

(1.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物研究中心,江蘇 無錫 214122)

廚余垃圾主要成分包括米和面粉類食物殘余、蔬菜、肉骨等，據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2018年，全國廚余垃圾產(chǎn)生量已達到10 800萬t。由于人口增長和城市化的加速，近年來國內(nèi)廚余垃圾的年增長率估計超過10%[1]，實現(xiàn)廚余垃圾的減量化、資源化及無害化是亟待解決的環(huán)境問題。

目前，國內(nèi)外廚余垃圾處理方法主要分為兩大類，一類是非生物處理法，主要包括衛(wèi)生填埋[2]、焚燒等；第二類是生物處理法，主要有堆肥[3]、厭氧發(fā)酵[4-5]、深度發(fā)酵產(chǎn)氫[6]、飼料化[7]以及廚余垃圾處理器[8]等。填埋和焚燒的資源化水平極低，且易造成環(huán)境的二次污染[9]，所以就地化、快速化處理廚余垃圾的生物處理及利用微生物菌劑的研究越來越引起人們的重視。徐銳[10]研究了一種高效降解廚余垃圾的復(fù)合微生物菌劑，處理48 h后質(zhì)量減少了40%。咸芳[11]自制微生物菌劑，當(dāng)接種量為8%，處理廚余垃圾72 h后質(zhì)量減少率最大可達78.5%。目前大部分的研究主要是針對微生物菌株的選擇，而鮮少有利用廚余垃圾為培養(yǎng)基原料來制備微生物復(fù)合菌劑的研究。

本研究基于“以廢治廢”理念，從不同來源的垃圾樣品中分離篩選耐高溫的高效降解菌株，針對廚余垃圾成分復(fù)雜、營養(yǎng)物質(zhì)不均衡等特點，以廚余垃圾浸出液為培養(yǎng)基，對菌株進行定向馴化，制成高活性復(fù)合微生物菌劑，并利用小型的廚余垃圾處理器進行實用性試驗，以期為今后廚余垃圾降解菌株的制備和應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集及處理

樣品來自于江南大學(xué)學(xué)校食堂和周邊飯店，挑去塑料袋、紙巾等雜物后用粉碎機粉碎攪勻后備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5.0、NaCl 10.0、胰蛋白胨10.0。

固體油脂培養(yǎng)基[12](g/L)：NaCl 5.0、蛋白胨10.0、CaCl27H2O 0.1、Tween-80 10.0；1.0%中性紅水溶液1 mL，橄欖油乳化液(2%聚乙烯醇與橄欖油體積比為3∶ 1制成乳化液) 50 mL，pH調(diào)至7.4。

固體淀粉培養(yǎng)基[13](g/L)：蛋白胨10.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、可溶性淀粉2.0、瓊脂15.0～20.0；pH 7.2～7.4。

固體纖維素培養(yǎng)基[12](g/L)：KH2PO40.5、MgSO40.25、CMC-Na 1.88、剛果紅0.2、瓊脂16.0、明膠2.0；pH 7.0。

固體蛋白培養(yǎng)基[13](g/L)：脫脂奶粉50.0、可溶性淀粉10.0、酵母膏5.0、KH2PO41.0、MgSO47H2O 0.2、瓊脂20.0；pH 7.0～7.2 。

固體廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基(g/L)：廚余垃圾浸出液1 000，瓊脂15.0～20.0。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃條件下滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 廚余垃圾浸出液的制備及測定方法

廚余垃圾浸出液制備：將預(yù)處理(挑去塑料袋、紙巾等雜物)的廚余垃圾用粉碎機粉碎攪勻，置于加熱容器中，加入3倍質(zhì)量的水，100 ℃加熱2 h，冷卻后過830 μm篩，將液體部分置于4 750 r/min離心機常溫下離心1 h，去油后取液體部分。

化學(xué)需氧量(COD)檢測用快速烘箱法[14]；有機碳含量采用LY/T 1237—1999方法測定，總氮含量采用凱式定氮法[15]測定，C/N比為有機碳含量/總氮含量。

1.2.2 菌株的分離篩選

耐高溫菌株的篩選：由于廚余垃圾處理溫度一般為45～50 ℃，故采用45 ℃高溫篩選不同來源的垃圾樣品。稱取3.0 g樣品至裝有50 mL無菌水的試管中，充分振蕩混勻。將裝有樣品懸液的試管置于45 ℃水浴鍋中水浴20 min并適當(dāng)振蕩。吸取1 mL樣品懸液進行10X系列梯度稀釋。分別取各梯度稀釋液0.1 mL涂布于LB培養(yǎng)基，倒置于45 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h，觀察菌落生長情況。分離純化。篩選出的菌株用編號A1、A2、A3……表示。

蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和油脂降解菌的篩選：將分離好的菌株點接于蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和油脂篩選培養(yǎng)基中，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。采用透明圈法初步確定各菌種降解相應(yīng)有機質(zhì)的能力。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

將篩選得到的菌株提取基因組[16]，選用rDNA長度為1 501 bp的片段進行PCR擴增[16]。擴增產(chǎn)物送至天霖生物科技無錫有限公司檢測。將16S rDNA序列測序所得序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST程序進行比對分析，并利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 篩選菌株的馴化

將篩選的菌株分別稀釋涂布于廚余垃圾浸出液的固體培養(yǎng)基，45 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔8 ～12 h將菌株生長最大的挑選出來，再接入下一個培養(yǎng)基，不斷繼代馴化，最終獲得對廚余垃圾浸出液有更好耐受力以及生長快速穩(wěn)定的菌株。

1.2.5 菌株活菌數(shù)及胞外酶活測定

活菌數(shù)測定：將馴化前后的菌株經(jīng)活化后分別接種于廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基中，搖床45 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，測定其活菌數(shù)[17]。

粗酶液的制備：將馴化前后的各菌種以1%(體積分數(shù))的接種量接種至廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基，45 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，取培養(yǎng)一定時間的發(fā)酵液，于10 000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液。

胞外酶活測定采用淀粉酶活的3，5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法[18]，酶活力定義：每毫升粗酶液每分鐘水解淀粉生成1 μg還原糖所用的酶量定義為一個酶活單位，以“U/mL”表示。蛋白酶(SB/T 10317-1999)酶活力定義：每毫升粗酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所用的酶量定義為一個酶活單位，以“U/mL”表示。脂肪酶活(對硝基苯酚法)[19]，每毫升粗酶液每分鐘催化水解底物對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酸(p-NP)所需的酶量定義為一個酶活單位，以“U/mL”表示。纖維素酶活(DNS顯色法)[20]，每毫升粗酶液每分鐘水解纖維素生成1 μg還原糖所用的酶量定義為一個酶活單位，以“U/mL”表示。

1.3 復(fù)合微生物菌劑的制備

復(fù)配比例：將廚余垃圾用粉碎機粉碎攪勻，每個錐形瓶中裝40 g后滅菌，按照1%的比例投加篩選的單菌及復(fù)合菌劑，設(shè)定不同的菌劑復(fù)配比例，E1為A1、A2、A7與A8復(fù)配(體積比為1∶ 1∶ 1∶ 1)、E2為A1、A2、A7與A8復(fù)配(體積比為2∶ 1∶ 1∶ 1)、E3為A1、A2、A7和A8復(fù)配(體積比為1∶ 2∶ 1∶ 1)、E4為A1、A2、A7和A8復(fù)配(體積比為1∶ 1∶ 2∶ 1)、E5為A1、A2、A7和A8(體積比為1∶ 1∶ 1∶ 2)，設(shè)置對照組CK為不添加任何微生物菌劑。將樣品置于45 ℃搖床中，轉(zhuǎn)速為150 r/min。

發(fā)酵條件：裝液量3 L/5 L，通氣量1.5 vvm，接種量為5%，溫度為45 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min，pH電極在線監(jiān)控，并用10 mol/L的KOH維持pH為7.0，發(fā)酵時間為30 h。

菌劑制備:按A1、A2、A7與A8菌液的體積比為2∶ 1∶ 1∶ 1混合后加入40 g/L海藻糖、10 g/L脫脂奶粉、10 g/L甘油做保護劑，按照質(zhì)量比3∶ 1加入麩皮與沸石粉的混合載體，烘箱45 ℃制備復(fù)合菌劑。菌泥濕質(zhì)量為發(fā)酵液經(jīng)4 750 r/min離心30 min后所得固體的質(zhì)量，干質(zhì)量為在105 ℃烘箱烘至恒質(zhì)量的質(zhì)量。半衰期為菌劑活菌數(shù)降為一半時的時間。

1.4 廚余垃圾降解應(yīng)用實驗

實驗分為3組。實驗組：添加3%馴化后經(jīng)廚余垃圾浸出液培養(yǎng)的復(fù)合微生物菌劑。對照組1：添加3%未馴化的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的復(fù)合微生物菌劑。對照組2：添加3%的去離子水。實驗發(fā)酵倉初始溫度控制在45 ℃，48 h后考察廚余垃圾的質(zhì)量損失率。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐高溫降解菌分離篩選與鑒定

共篩選出18株耐高溫的菌株，分別編號為A1～A18。

將初篩得到的18株菌株分別點接到淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和纖維素的4種鑒別培養(yǎng)基上，通過觀察各菌株的菌落直徑(D0)和透明圈直徑(D)的大小來初步判斷各菌株對各有機物的降解能力，用D/D0表示，結(jié)果如表1所示。

由表1可知：每株菌株對淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和纖維素的降解能力不同，綜合考慮各菌株對淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和纖維素有機物的降解能力，選擇A1、A2、A7和A8酶活較強的4株菌作為候選菌株，對菌株進行鑒定。

表1 各菌株對淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素的降解能力

將篩選的4菌株在LB培養(yǎng)基上進行劃線分離，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落形態(tài)、顏色、菌落邊緣，再對菌株進行革蘭氏染色，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：A1菌株為乳黃色不透明，微凸有褶皺，革蘭氏染色為陽性；A2菌株為乳白色不透明，扁平無褶皺，革蘭氏染色為陽性；A7菌株為乳黃色不透明，微凸有褶皺，革蘭氏染色為陽性；A8菌株為乳黃色不透明，微凸有褶皺，革蘭氏染色為陽性。

圖1 菌株形態(tài)及革蘭氏染色圖Fig.1 Colony morphology and Gram staining of strains

測序比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。由圖2可確認：A1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、A2為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、A7為特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、A8為嗜溫鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumthalpophilum)。

圖2 篩選菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strains

2.2 基于廚余垃圾培養(yǎng)基的菌株馴化及菌劑制備

2.2.1 馴化前后的活菌數(shù)對比

為考察馴化前后的菌株生長情況，將馴化前后的菌株分別接種于廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基中，測定其活菌數(shù)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：廚余垃圾浸出液中雖含有豐富的碳源和氮源，但成分多且復(fù)雜、營養(yǎng)物質(zhì)不均衡，使得菌株生長情況不如細菌常用的LB培養(yǎng)基(圖3(a))。通過廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基的定向馴化，強化菌株對生長環(huán)境的適應(yīng)性，在馴化過程中形成有利于自身生長繁殖的適應(yīng)性機制。通過適應(yīng)性馴化，培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)有了顯著的提高，馴化后的菌株比LB培養(yǎng)基中的活菌數(shù)更高(圖3(b))，A1、A2、A7和A8各菌株活菌數(shù)較馴化前分別提高了85.2%、94%、88.9%和44.9%。

圖3 篩選菌株馴化前后在LB培養(yǎng)基和廚余浸出液培養(yǎng)基(CY)中的活菌數(shù)對比Fig.3 Comparison of the number of viable bacteria in LB medium and CY medium before and after acclimation

2.2.2 馴化前后的菌株胞外酶活對比

蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪和纖維素等都屬于大分子物質(zhì)，微生物不能直接吸收利用，必須通過分泌到體外的胞外酶作用來水解這些大分子物質(zhì)，進而轉(zhuǎn)化為簡單的氨基酸、葡萄糖等小分子物質(zhì)，因此，菌株胞外酶活直接影響微生物的降解效能?？疾祚Z化前后的菌株胞外酶活情況，結(jié)果如圖4所示。

圖4 篩選菌株馴化前后在廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基中的酶活變化Fig.4 Changes of enzyme activity in food waste extract medium before and after acclimation

由圖4可知：馴化前后的菌株在相同廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，馴化后菌株的酶活均高于馴化前，其中最顯著的是A1菌株脂肪酶活提高了50.8%。洪駿等[21]發(fā)現(xiàn)油脂作為碳源對脂肪酶的產(chǎn)生具有一定的誘導(dǎo)作用。由此可見：廚余垃圾浸出液中所含有的淀粉、脂肪、蛋白和纖維素等物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，提高酶的合成，加快廚余垃圾分解代謝。

2.2.3 復(fù)合微生物菌劑的制備

將篩選的4菌株按照不同比例投加到實驗室小試的廚余垃圾樣品中，48 h后的降解效果如圖5所示。由圖5可知：添加菌劑的處理效果明顯高于不添加菌劑的CK組，表明添加微生物菌劑能明顯提高廚余垃圾的降解效果；而復(fù)合菌劑的處理效果明顯高于單菌的處理效果，表明篩選菌劑的復(fù)合在廚余垃圾處理有協(xié)同效果，且在E2時降解效果達到最佳為50.16%，即A1、A2、A7與A8菌的復(fù)合比例為2∶ 1∶ 1∶ 1，故后續(xù)的菌劑制備選用E2的復(fù)配比例。

圖5 微生物復(fù)配比例對廚余垃圾降解的影響Fig.5 Effects of microbial compound proportion on degradation capacity of food waste

利用廚余垃圾浸出液將馴化獲得的菌株制備成復(fù)合微生物菌劑，菌劑制備結(jié)果如表2所示，并將所獲得的菌劑進行應(yīng)用。

表2 菌劑制備參數(shù)

2.3 廚余垃圾降解應(yīng)用的應(yīng)用

質(zhì)量減少率是評價微生物降解過程的指標(biāo)，表3列出了廚余垃圾降解前后的質(zhì)量，由表3可知：加入微生物菌劑(實驗組)能加快廚余垃圾中有機質(zhì)的降解速率，在48 h后廚余垃圾的質(zhì)量減少率達到最大值73.8%，與加入未馴化的微生物菌劑(對照組1)相比，質(zhì)量減少率提高了近10%，與未加菌劑的對照組2相比，質(zhì)量減少率提高了35.1%。本研究利用自制的高效微生物菌劑應(yīng)用于廚余垃圾處理器，在48 h廚余垃圾的質(zhì)量減少率達到最大值73.8%，高于徐銳[10]研究的微生物菌劑40%的降解效果，接近咸芳[11]的報道的72 h降解達到78.5%，但大大縮短了發(fā)酵周期，效果明顯，非常適合應(yīng)用于廚余垃圾的降解。

表3 廚余垃圾質(zhì)量減少率

3 結(jié)論

從不同來源的垃圾樣品中分離篩選出18株耐高溫的菌株，通過45 ℃的溫度篩選及平板透明圈法分析各菌株對淀粉、纖維素、蛋白和脂肪的降解能力，綜合考慮各菌株的降解能力,選擇A1、A2、A7、A8菌株；經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確認篩選的菌株A1、A2、A7、A8分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、嗜溫鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumthalpophilum)，其中嗜溫鞘氨醇桿菌對廚余垃圾有顯著的降解效果未見報道。

經(jīng)定向馴化，A1、A2、A7、A8在廚余垃圾浸出液培養(yǎng)基上生長及胞外酶活顯著提高；制成菌劑后應(yīng)用于廚余垃圾的降解質(zhì)量減少，質(zhì)量減少率達到73.8%，與對照組相比，質(zhì)量減少率分別提高約10%和35.1%；利用廚余垃圾為原料制備的浸出液作為培養(yǎng)基馴化和菌劑制備的原料，不僅讓廢棄物資源得到了最大化利用，同時還提高了廚余垃圾處理效能，為廚余垃圾處理提供了一種思路。