種子消毒方法對大蔥無菌苗培養(yǎng)的影響

董 飛 陳運起 劉世琦 高莉敏 王傳增

（1山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，山東泰安 271018；2山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，山東省設施蔬菜生物學重點實驗室，國家蔬菜改良中心山東分中心，山東濟南 250100）

大蔥（Allium fistulosumL.）為百合科蔥屬二年生草本植物。我國栽培利用大蔥的歷史逾3 000 a，現(xiàn)全國各地均有栽培（周光華，1999）。近年來，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展和基因工程的日趨普及，利用轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)藥物、疫苗和生物制劑愈加展示出廣闊的應用前景和潛在的經(jīng)濟效益。在轉(zhuǎn)基因植株的研究中，無菌苗的篩選和培育是試驗成功的關(guān)鍵，而無菌苗一般由種子獲得，因此，種子有效消毒顯得尤為重要。迄今，各種滅菌方法報道頗多（Sommer et al.，1981；Dodds & Roberts，1996；Pierik，1997；吳良歡和陶勤南，1997，1999；楊嵐 等，2008），但是有關(guān)大蔥種子消毒的方法鮮有報道。本試驗以大蔥種子為材料，設計不同的消毒方法，觀察記錄大蔥種子始發(fā)期、發(fā)芽率、發(fā)芽勢及污染率，為大蔥種子的有效消毒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供的章丘大蔥種子為試材。次氯酸鈉、升汞、吐溫20等藥劑購自濟南凱萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 種子消毒處理

種子消毒處理方法：每個處理200粒種子，先將大蔥種子用自來水沖洗30 min，然后置于超凈工作臺上用75%酒精漂洗0.5～1.0 min，轉(zhuǎn)入消毒液中進行消毒處理，最后用無菌水沖洗3～5遍，接種于MS培養(yǎng)基。

種子消毒試驗設計：① 2%次氯酸鈉消毒20 min；② 2%次氯酸鈉消毒40 min；③ 2%次氯酸鈉消毒60 min；④ 0.1%升汞消毒5 min；⑤ 0.1%升汞消毒10 min；⑥ 0.1%升汞消毒15 min。

1.3 添加吐溫20的種子消毒處理

吐溫20是一種去污劑，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，能夠濕潤整個種子，促進消毒液進一步接觸表面組織，吸附種子內(nèi)部的內(nèi)生菌，從而達到更好的消毒效果。

處理方法：每個處理100粒種子，先用自來水沖洗30 min，然后置于超凈工作臺上用75%酒精漂洗0.5～1.0 min，轉(zhuǎn)入2%次氯酸鈉消毒40 min，隨后接種于MS培養(yǎng)基。

試驗設計：① 大蔥種子消毒前，用自來水沖洗時在三角瓶中加入 1～2滴吐溫 20；② 大蔥種子消毒后，用加入吐溫20的無菌水〔無菌水中按10 000V∶1V（梁毅 等，2010）的比例添加吐溫20〕沖洗3～5遍，最后用無菌水沖洗1遍；③ 處理1與處理2同時進行；④ 以正常消毒，不添加吐溫20為對照。

1.4 大蔥無菌苗培養(yǎng)

將處理后的種子接種于MS培養(yǎng)基（經(jīng)高壓滅菌）培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加3%蔗糖、0.9%瓊脂，pH 5.8～6.0。培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強度3 000 lx，光照時間每天16 h。

1.5 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)10 d時調(diào)查統(tǒng)計發(fā)芽勢；培養(yǎng)30 d時調(diào)查統(tǒng)計發(fā)芽率、污染率；第1粒種子發(fā)芽的時間為種子發(fā)芽始期。采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對大蔥種子發(fā)芽及消毒效果的影響

由表1可知，采用2%次氯酸鈉、0.1%升汞兩種試劑不同時間處理大蔥種子，處理1的種子始發(fā)期最短，僅為3 d，與處理4、5差異顯著，與處理 6差異極顯著；在發(fā)芽率和發(fā)芽勢方面，也是處理1最高，分別達88.0%和79.0%，且在發(fā)芽勢上與其他 5個處理存在極顯著差異，但是其污染率亦最高（12.0%），從而影響最終的成苗率。處理6的污染率最低，為1.0%，但發(fā)芽率和發(fā)芽勢也最低，而且種子始發(fā)期比其他處理推遲2～4 d，不利于種子成苗。處理2種子始發(fā)期、發(fā)芽率與處理1無顯著差異，但種子污染率較低（5%），是對大蔥種子進行消毒，實現(xiàn)較高發(fā)芽率、較低污染率的理想方法。

表1 不同消毒方法對大蔥種子發(fā)芽及消毒效果的影響

2.2 添加吐溫20對大蔥種子發(fā)芽及消毒效果的影響

由表2可知，在大蔥種子消毒過程中添加吐溫 20，能顯著降低種子污染率，明顯提高發(fā)芽勢、發(fā)芽率，因此可以認定添加吐溫 20對大蔥種子消毒處理有積極作用。處理3消毒效果最佳，種子始發(fā)期提前 2 d，發(fā)芽勢達81%、發(fā)芽率達90%，而污染率僅為2.5%。

表2 添加吐溫20對大蔥種子發(fā)芽及消毒效果的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 不同消毒方法的效果比較

種子消毒不僅要把表面的微生物殺死，而且不能傷害其組織和表層細胞，以獲得不污染且存活率較高的外植體。常見的消毒劑有次氯酸鈉、酒精、升汞、過氧化氫、漂白粉等。其中升汞的殺菌能力最強，但對外植體的傷害最大，毒性也大，污染環(huán)境。不同植株對升汞的耐受能力不同，Rao等（2006）采用0.1%升汞對棉花種子進行表面消毒時，消毒時間長達20 min也沒有對種子造成傷害，但是解繼紅等（2009）在鵝觀草屬種子消毒試驗中證明 0.1%升汞消毒3 min效果最佳。本試驗采用0.1%升汞對大蔥種子進行消毒（5～15 min）時，升汞對大蔥種子的抑制作用太強，致使大蔥種子生長勢、發(fā)芽勢弱，發(fā)芽持續(xù)時間長，且消毒效果也不如2%次氯酸鈉。

3.2 添加吐溫20對大蔥種子消毒效果的影響

吐溫20是一種親水性強的非離子型去污劑，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，能夠濕潤整個種子，促進消毒液進一步接觸表面組織，吸附種子內(nèi)部的內(nèi)生菌，從而達到更好的消毒效果（王利民 等，2002）。本試驗結(jié)果表明，吐溫 20在大蔥種子消毒中能夠有效的去除種子表面的灰塵和雜質(zhì)，對大蔥種子的有效消毒是十分重要的。尤其是在消毒前后均加吐溫20（處理3），大蔥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢有明顯提高，而且污染率低。因此，用2%次氯酸鈉消毒40 min，在消毒前后均添加吐溫20為大蔥種子有效的消毒方法。

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