黨參無(wú)菌苗培養(yǎng)前種子消毒技術(shù)研究

薛雯心 魏鐵鎖 袁金月 劉立業(yè) 姜雪琪 李秀霞

摘要[目的]研究不同消毒方法下黨參種子的消毒效果。[方法]以黨參種子為試驗(yàn)材料，通過(guò)10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO這3種消毒劑，75%乙醇預(yù)處理，無(wú)菌水預(yù)浸泡，對(duì)黨參種子的消毒效果進(jìn)行比較。[結(jié)果]在10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO這3種消毒劑中，2%NaClO浸種20 min的消毒效果最好；用75%乙醇預(yù)處理20 s可降低種子帶菌率；在黨參種子消毒之前，無(wú)菌水預(yù)浸泡24 h可提高發(fā)芽率。[結(jié)論]該研究結(jié)果為培育黨參無(wú)菌苗等研究提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞黨參；種子消毒；無(wú)菌苗

中圖分類(lèi)號(hào)S567.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）12-0130-02

Abstract[Objective]To study the disinfection effects of Codonopsis pilosula seedling under different disinfection treatments.[Method]Taking C.pilosula seeds as test materials，through three kinds of disinfectants 10%H2O2， 0.1% HgCl2 and 2% NaClO，pretreatment with 75% ethanol and presoaking with sterile water，the effects of

C.pilosula seed sterilization were studied.[Result]2%NaClO had the greatest sterilization effect.The germcarring rate of seed was decreased with pretreatment of 75% ethanol.The seeds were soaked in aseptic water for 24 hours before sterilization，the seeds germination rate could increase.[Conclusion]The results of this study provide an important basis for the research on the cultivation of sterile seedlings of C.pilosula.

Key wordsCodonopsis pilosula；Seed disinfection；Aseptic seedling

黨參[Codonopsis pilosula（Franch.） Nannf.]為桔?？贫嗄晟俦局参?，分布于甘肅、山西、四川、云南和黑龍江等地，其性味甘平、無(wú)毒，有活血化淤、補(bǔ)中益氣、生津止渴等功效，主治脾肺虛弱、內(nèi)熱消渴、食少便溏、氣短心悸、虛喘咳嗽等癥[1]，為我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥，臨床上可單獨(dú)使用，也可以與其他中藥配合使用。近年來(lái)，在黨參治療冠心病、高血脂癥、低血壓病和功能性子宮出血等病癥方面取得了新的進(jìn)展，并將黨參用于保健食品的研制與開(kāi)發(fā)，使其用量速增[2]。

黨參的市場(chǎng)需求量很大，傳統(tǒng)的遺傳育種易受環(huán)境[3]、季節(jié)和病蟲(chóng)害的影響，而且傳統(tǒng)的遺傳育種有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、見(jiàn)效慢等缺點(diǎn)[4-5]。建立黨參組織培養(yǎng)高頻再生體系，可以為以后培育新的品種奠定基礎(chǔ)。用黨參種子培育無(wú)菌苗，再將獲取的外植體用于組織培養(yǎng)顯得至關(guān)重要。筆者研究了不同消毒方法對(duì)黨參種子消毒效果的影響，探索出黨參無(wú)菌苗培養(yǎng)前種子最佳消毒方法，為黨參無(wú)菌苗的培育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料黨參種子由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所提供。浸種消毒劑為10%H2O2、0.1%HgCl2和2%NaClO；表面消毒劑為75%乙醇；種子預(yù)浸泡處理采用無(wú)菌水；培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1最佳消毒劑及消毒時(shí)間的選擇。

該試驗(yàn)為2 因子試驗(yàn)，因子 1 為消毒劑，包括 3 個(gè)處理：10%H2O2、0.1%HgCl2、2%NaClO；因子2為消毒時(shí)間，即每種消毒劑分別處理10、20、30 min。共9個(gè)處理組合，每處理3次重復(fù)，每重復(fù) 50 粒種子。消毒后的種子用無(wú)菌水沖洗 5～6次，每次1～2 min，然后將種子接種于 MS 培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)，計(jì)算黨參種子的平均帶菌率和平均發(fā)芽率。

1.2.2乙醇預(yù)處理的選擇。

選籽粒飽滿、大小基本一致的種子200粒，分為2組（即2個(gè)處理），每處理100粒種子，每處理3次重復(fù)，每重復(fù) 50 粒種子。處理 1：將種子在75%乙醇中預(yù)浸泡20 s，再用2%NaClO消毒處理；處理 2：種子不經(jīng)過(guò)乙醇浸泡，直接用2%NaClO進(jìn)行消毒。將不同處理的黨參種子接種于 MS 培養(yǎng)基，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果觀察并記錄。

1.2.3種子預(yù)浸泡的選擇。選籽粒飽滿、大小基本一致的種子450粒，分為3組（即3個(gè)處理），每處理 150 粒種子。處理 1：將種子用無(wú)菌水在常溫下浸泡12 h；處理 2：將種子用無(wú)菌水在常溫下浸泡 24 h；處理 3：種子不浸泡。將3個(gè)處理分別用75%乙醇浸泡20 s，再用2%的NaClO消毒20 min。最后將不同處理的黨參種子接種于 MS 培養(yǎng)基，每處理3次重復(fù)，每重復(fù) 50 粒種子，用高分子膜封口，觀察并統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)種子消毒效果的影響

從表1可以看出，不同消毒劑處理的黨參種子，表現(xiàn)出不同的效果。10%H2O2消毒10 min的種子發(fā)芽率為43.33%，培養(yǎng)基呈紅色，污染十分嚴(yán)重，不利于無(wú)菌苗的種子培養(yǎng)，10%H2O2消毒20 min的種子發(fā)芽率為66.67%，較10%H2O2消毒10 min的種子發(fā)芽效果好，10%H2O2消毒30 min的種子發(fā)芽率為48.00%。0.1%HgCl2消毒10 min的種子發(fā)芽率為57.33%，0.1%HgCl2消毒20 min的種子發(fā)芽率為83.33%，0.1%HgCl2消毒30 min的種子發(fā)芽率為62.67%?？梢?jiàn)，0.1%HgCl2消毒處理后的種子發(fā)芽率均高于用10%H2O2消毒處理后的種子發(fā)芽率。2%NaClO消毒10 min的種子發(fā)芽率為81.33%，2%NaClO消毒20 min的種子發(fā)芽率最高，為90.00%，2%NaClO消毒30 min的種子發(fā)芽率為80.00%。0.1%HgCl2消毒20 min的種子發(fā)芽率（83.33%）僅次于2%NaClO浸種20 min的種子發(fā)芽率（90.00%）。但是，將0.1%HgCl2浸種20 min和2%NaClO浸種20 min的消毒效果相比較，前者的污染率明顯高于后者。綜合以上結(jié)果，2%NaClO浸種20 min消毒效果最佳。

2.2乙醇預(yù)處理對(duì)黨參種子消毒效果的影響

75%乙醇浸泡20 s與不浸泡黨參種子2個(gè)處理的結(jié)果表明，75%乙醇浸泡20 s的種子平均帶菌率低于不浸泡處理。由表2可知，75%乙醇浸泡20 s的種子平均帶菌率為7.00%，比不浸泡處理低2.00百分點(diǎn)。而且，75%乙醇浸泡20 s的種子發(fā)芽率為91.00%，明顯高于不浸泡處理。可見(jiàn)，75%乙醇浸泡20 s對(duì)種子消毒有很好的效果。

2.3預(yù)浸泡對(duì)黨參種子消毒效果的影響

從表3可以看出，黨參種子不浸泡處理的平均發(fā)芽率顯著低于浸泡處理。未經(jīng)過(guò)無(wú)菌水預(yù)浸泡處理的種子發(fā)芽率為86.00%，無(wú)菌水浸泡12 h的種子發(fā)芽率為92.00%，無(wú)菌水浸泡24 h的種子發(fā)芽率最高，為94.67%。不浸泡處理的種子帶菌率比浸泡12 h的種子帶菌率高2.00百分點(diǎn)，比浸泡24 h的種子帶菌率高6.00百分點(diǎn)，浸泡24 h的種子平均帶菌率最低，為1.33%。從以上結(jié)果可以看出，無(wú)菌水浸泡24 h能有效提高種子發(fā)芽率，同時(shí)降低種子帶菌率。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)中HgCl2的消毒效果不如NaClO，雖然0.1%HgCl2消毒20 min的發(fā)芽率僅次于2%NaClO消毒20 min的處理，但HgCl2處理的種子污染率普遍高于NaClO處理。用10%H2O2對(duì)黨參種子消毒處理時(shí)，消毒時(shí)間過(guò)短，培養(yǎng)基污染十分嚴(yán)重，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，種子會(huì)向外滲透營(yíng)養(yǎng)物，所以不適宜選H2O2作為黨參種子的消毒劑。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，殘留在種子上的消毒劑也會(huì)影響種子發(fā)芽率，所以，經(jīng)過(guò)消毒劑處理后的種子要用無(wú)菌水沖洗5～6次，每次1～2 min。綜合以上結(jié)果，用2%NaClO浸種20 min是最佳選擇。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，采用75%乙醇浸泡預(yù)處理種子，有效降低了種子帶菌率，種子經(jīng)75%乙醇浸泡預(yù)處理后再用2%NaClO消毒，比直接用2%NaClO消毒的種子帶菌率低2.00百分點(diǎn)。而且75%乙醇浸泡預(yù)處理消毒后的種子發(fā)芽率為91.00%，比不浸泡處理的種子發(fā)芽率高6.00百分點(diǎn)。75%乙醇能有效降低種子表面的帶菌率，但預(yù)處理時(shí)間不能太長(zhǎng)，20 s為處理黨參種子的最佳時(shí)間。

黨參種子浸泡與否對(duì)消毒效果的影響研究表明，種子經(jīng)浸泡后，其種皮結(jié)構(gòu)變松軟[6]，消毒劑更易滲入。在種子消毒之前，無(wú)菌水浸泡12 h后再經(jīng)2%NaClO消毒的種子帶菌率為5.33%，無(wú)菌水浸泡24 h后再經(jīng)2%NaClO消毒的種子帶菌率為1.33%，而未經(jīng)過(guò)無(wú)菌水浸泡的種子帶菌率為7.33%。發(fā)芽率最低的為不浸泡的種子，浸泡12 h的種子比不浸泡種子的發(fā)芽率高6.00百分點(diǎn)，浸泡24 h比浸泡12 h的種子發(fā)芽率高2.67百分點(diǎn)。可見(jiàn)，種子預(yù)浸泡能提高消毒劑的消毒效果，無(wú)菌水預(yù)浸泡24 h有效提高了種子發(fā)芽率。

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