組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275在體外抑制胃癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

劉瑾 任亞嬋 吳智群

1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069；2.第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院介入放射科，陜西 西安，710038

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡人數(shù)在我國(guó)居惡性腫瘤的首位［1］，每年約有17萬(wàn)人死于胃癌。手術(shù)對(duì)早期胃癌有較好的療效，但對(duì)中晚期的胃癌療效欠佳。由于化療和放療對(duì)胃癌的有效率均較低，因此，尋找不良反應(yīng)小，療效好的腫瘤靶向治療藥物已經(jīng)成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙?；腿ヒ阴；诨虻谋磉_(dá)調(diào)控中起著非常重要的作用，組蛋白乙酰化和去乙?；奈蓙y與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［2］。進(jìn)一步研究證實(shí)，組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACis)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、生長(zhǎng)抑制及凋亡［3］，已經(jīng)成為一種抗癌新藥受到越來(lái)越多的關(guān)注，MS-275就是眾多HDACis之一。MS-275是一種合成的苯甲酰胺衍生物，能顯著抑制HDAC1(IC50=300 nmol/L)和HDAC3(IC50=8 μmol/L)，對(duì)HDAC8(IC50>100 μmol/L)抑制效果不佳。MS-275對(duì)腫瘤細(xì)胞作用強(qiáng)，不良反應(yīng)相對(duì)較小，且在人體內(nèi)穩(wěn)定性好，并且MS-275可以通過(guò)微芯生物設(shè)計(jì)合成，還可通過(guò)口服途徑給藥，具有較好的臨床應(yīng)用前景［4］。本研究旨在研究MS-275對(duì)胃癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的作用，以期闡明MS-275對(duì)胃癌細(xì)胞的選擇性殺傷作用，為臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

MS-275購(gòu)于美國(guó)Merck公司，SGC-7901(人胃低分化腺癌)細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物中心提供，GES-1(人正常胃黏膜細(xì)胞)和張氏肝細(xì)胞(CHANG-LIVER)購(gòu)于博慧斯生物公司，RPMI1640培養(yǎng)液及胰蛋白酶購(gòu)于Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于Sigma公司，TUNEL檢測(cè)試劑盒(in situ cell death detection kit，POD)購(gòu)于Roche公司；Cell Proliferation Reagent WST-1購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901和張氏肝細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；GES-1用含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MS-275對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)影響的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，用胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，以1×104mL-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，共接種5塊96孔板，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。待24 h細(xì)胞完全貼壁后，加入MS-275，終濃度設(shè)置1、2、4和8 μmol/L的濃度梯度，每個(gè) 濃度3個(gè)平行孔，對(duì)照組不加MS-275。每24 h取出一塊96孔板，每孔加WST-1 10 μL，37 ℃溫箱中溫育4 h后酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光值(D)，以 空白對(duì)照孔調(diào)零 ，根據(jù)吸光值結(jié)果計(jì)算：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將貼壁良好的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h，經(jīng)一定濃度MS-275處理48 h，對(duì)照組細(xì)胞為同樣條件下的不加藥細(xì)胞。收集處理組和對(duì)照組細(xì)胞，控制密度在1×106mL-1左右，PBS清洗2次，加入190 μL Annexin V緩沖液，再加入10 μL Annexin V-FITC(20 μg/mL)，混勻，室溫溫育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC緩沖液，再加入10 μL PI(20 μg/mL) 輕輕混勻，冰浴避光放置，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.5 TUNEL實(shí)驗(yàn)

按照Roche公司POD的操作說(shuō)明進(jìn)行操作實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MS-275對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

一定濃度的MS-275對(duì)SGC-7901細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且這種抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。處理時(shí)間越長(zhǎng)，濃度越高，抑制作用越明顯。與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 不同濃度的MS-275給藥不同時(shí)間后對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Tab.1 The inhibition of different concentration of MS-275 on cell growth of SGC-7901 cell in different time(n=3)

2.2 MS-275對(duì)SGC-7901細(xì)胞及正常細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

設(shè)不加MS-275的對(duì)照組、1和4 μmol/L MS-275處理48 h的SGC-7901細(xì)胞和正常細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率分別為2.7%、7.5%和38.1%(圖1)；正常細(xì)胞GES-1的凋亡率分別為0.63%、0.43%和1.06%(圖2)；張氏肝細(xì)胞的凋亡率分別為1.47%、2.97%和2.85%(圖3)。一定濃度MS-275(2 μmol/L)分別處理SGC-7901細(xì)胞24、48和72 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率分別為3.5%、21%和5 8.5%(圖4)。

圖1 MS-275對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用呈劑量依賴(lài)性Fig.1 Apoptosis in SGC-7 901 cell induced by MS-275 is a concentration-dependent mode

圖2 MS-275對(duì)人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的作用Fig.2 The effect on human normal gastric mucosal cell GES-1 after treated by MS-275

2.3 TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)生凋亡的細(xì)胞

2 μmol/L MS-275處理SGC-7901細(xì)胞48 h后，TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法)染色，可特異性標(biāo)記細(xì)胞核內(nèi)的DNA斷裂末端，觀察到MS-275處理后的細(xì)胞，核內(nèi)被綠色熒光標(biāo)記，MS-275未處理的對(duì)照組則沒(méi)被染色。

圖3 MS-275對(duì)人正常肝細(xì)胞張氏肝細(xì)胞的作用Fig.3 The effect on human normal hepatic ce ll CHANGLIVER after treated by MS-275

圖4 MS-275對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用呈時(shí)間依賴(lài)性Fig.4 Apoptosis in SGC-7901 cell induced by MS-275 was a time-dependent mode

圖5 TUNEL實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖Fig.5 TUNEL experimental comparison picture

3 討 論

組蛋白乙?；钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳修飾的一種，調(diào)節(jié)組蛋白乙?；潭戎饕山M蛋白乙?；?histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)來(lái)相互協(xié)調(diào)完成。組蛋白乙?；蓙y可能會(huì)導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。分化以及凋亡的基因轉(zhuǎn)錄水平的失調(diào)［5］。組蛋白乙?；癄顟B(tài)利于基因表達(dá)，反之去乙?；瘎t與基因沉默相關(guān)，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都存在著高度的組蛋白乙?；?］。HDACis可以抑制HDACs的作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)制，成為近年來(lái)的抗癌藥物的研究熱點(diǎn)。MS-275是一種新型的苯酰胺類(lèi)的HDACis，MS-275可以通過(guò)微芯生物設(shè)計(jì)和合成，與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HDACis無(wú)結(jié)構(gòu)類(lèi)似性，但是抑制效率是NaB等天然HDACis的30倍［7］。值得關(guān)注的是，MS-275的確具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但是對(duì)于正常細(xì)胞卻基本上沒(méi)有作用。

SGC-7901細(xì)胞是人胃低分化腺癌細(xì)胞，在正常條件下生長(zhǎng)增殖旺盛，MS-275濃度梯度處理后， WST-1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MS-275抑制生長(zhǎng)的作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加而升高，即MS-275的作用具有時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。這與Baradari等［7］發(fā)表的MS-275對(duì)膽管癌細(xì)胞系的作用和曲巍等［8］報(bào)道的MS-275對(duì)膀胱癌細(xì)胞系的作用相一致。目前的研究證實(shí)MS-275主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期停滯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。正在凋亡的細(xì)胞一個(gè)比較典型的特征是細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)DNA斷裂。本實(shí)驗(yàn)中利用TUNEL 染色，可以在熒光顯微鏡下清楚觀察到經(jīng)過(guò)MS-275處理的SGC-7901細(xì)胞被染上綠色熒光，表明細(xì)胞核里的DNA發(fā)生斷裂，而未經(jīng)過(guò)MS-275處理的SGC-7901細(xì)胞則沒(méi)有被染色。同時(shí)利用AnnexinV/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在同一處理濃度下(2 μmol/L)，SGC-7901細(xì)胞分別處理24、48和72 h后，48 h后出現(xiàn)了非常明顯的凋亡，說(shuō)明MS-275確實(shí)會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，而在固定時(shí)間內(nèi)(48 h)分別用1和4 μmol/L的MS-275處理后，在較高濃度(4 μmol/L)時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，推測(cè)在低濃度時(shí)主要是誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯。為了證實(shí)MS-275對(duì)人正常細(xì)胞具有促凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)還設(shè)了兩種人正常細(xì)胞—人胃黏膜正常細(xì)胞GES-1和張氏肝細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在同等實(shí)驗(yàn)條件下，MS-275對(duì)正常細(xì)胞基本沒(méi)有誘導(dǎo)凋亡的作用，說(shuō)明MS-275的殺傷作用確實(shí)具有選擇性。

本實(shí)驗(yàn)僅是MS-275對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的驗(yàn)證，下一步計(jì)劃利用Western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)情況，以及caspase家族在MS-275誘導(dǎo)的凋亡中的作用，這將對(duì)深入了解MS-275的作用機(jī)制起重要作用。

［1］ USHIJIMA T, SASAKO M. Focus on gastric cancer［J］.Cancer Cell, 2004, 5(2): 121-125.

［2］ KRAMER O H, GOTTLICHER M, HEINZEL T. Histone deacetylase as a therapeutic target［J］. TRENDS Endocrinol Metabol, 2001, 12(7): 294-300.

［3］ CHOI J H, KWON H J, YOON B I, et al. Expression profile of histone deacetylase in gastric cancer tissues［J］. Jpn J Cancer Res, 2001, 92: 1300-1304.

［4］ MONNERET C. Histone deacetylase inhibitors［J］. Eur J Med Chem, 2005, 40(1): 1-13.

［5］ STUMPP H H, BRACKER T U, et al. MS-275, a potent orally available inhibitor of histone deacetylases-the development of an anticancer agent［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2007(39):1388-1405.

［6］ BATTY N, MALOUF G G, ISSA J P J. Histone deacetylase inhibitors as anti-neoplastic agents［J］. Cancer Letters,2009(280): 192-200.

［7］ BARADARI V, HOPFNER M, HUETHER A, et al. Histone deacetylase inhibitor MS-275 alone or combined with bortezomib or sorafenib exhibits strong antiproliferative action in human cholangiocarcinoma cells［J］. World J Gastroenterol, 2007, 13(33): 4458-4466.

［8］ 曲巍, 王立明, 朱有華, 等. 組蛋白去乙酰酶抑制劑 MS-275抑制膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)癌癥雜志, 2006,16(1): 5-8.

［9］ 馬健, 趙名, 于曉?shī)l, 等. 組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞株U266凋亡過(guò)程中Survivin的表達(dá)［J］.癌癥, 2009, 28(5): 466-471.